原核表達操作步驟及注意事項

將克隆化基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質(zhì)的方法一般稱(chēng)為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。大腸桿菌用于表達重組蛋白有以下特點(diǎn)：

易于生長(cháng)和控制；用于細菌培養的材料不及哺乳動(dòng)物細胞系統的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)?？晒┻x擇。但是，在大腸桿菌中表達的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學(xué)活性及構象。

表達載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達載體通常為質(zhì)粒，典型的表達載體應具有以下幾種元件：

（1）選擇標志的編碼序列；

（2）可控轉錄的啟動(dòng)子；

（3）轉錄調控序列(轉錄終止子，核糖體結合位點(diǎn))；

（4）一個(gè)多限制酶切位點(diǎn)接頭；

（5）宿主體內自主復制的序列。

原核表達一般程序如下：

獲得目的基因－準備表達載體－將目的基因插入表達載體中（測序驗證）－轉化表達宿主菌－誘導靶蛋白的表達－表達蛋白的分析－擴增、純化、進(jìn)一步檢測

一、試劑準備

1、LB培養基。

2、100mM IPTG（異丙基硫代-β-D^-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH₂O中，0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存。

二、操作步驟

（一）獲得目的基因

1、通過(guò)PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

2、通過(guò)RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第yi鏈，以逆轉錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

（二）構建重組表達載體

1、載體酶切：將表達質(zhì)粒用限制性?xún)惹忻福ㄍ锏拿盖形稽c(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

（三）獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種

1、將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α，根據重組載體的標志（抗Amp或藍白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。

2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。

3、以此重組質(zhì)粒DNA轉化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。

（四）誘導表達

1、挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃過(guò)夜培養。

2、按1∶50比例稀釋過(guò)夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中，37℃震蕩培養至OD₆₀₀ ≌0.4-1.0（OD600 0.6，大約需3hr）。

3、取部分液體作為未誘導的對照組，余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗組，兩組繼續37℃震蕩培養3hr。

4、分別取菌體1ml，離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl 1%SDS重懸，混勻，70℃10min。

5、離心12000g×1min，取上清作為樣品，可做SDS-PAGE等分析。

三、注意事項

1、選擇表達載體時(shí)，要根據所表達蛋白的終應用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達。

2、融合表達時(shí)在選擇外源DNA同載體分子連接反應時(shí)，對轉錄和轉譯過(guò)程中密碼結構的閱讀不能發(fā)生干擾。