您問(wèn)我答 Peprotech細胞因子溶解稀釋常見(jiàn)問(wèn)題

Peprotech的細胞因子或重組蛋白以?xún)龈煞鄣男问教峁?，無(wú)任何添加劑、賦形劑及蛋白載體，這使得細胞因子或重組蛋白非常穩定，在-20℃或-80℃可穩定保存數年，并且使用非常安全，對實(shí)驗結果影響較小。凍干粉在使用前需進(jìn)行溶解，以溶液的形式加入到培養體系或注入動(dòng)物體內。溶解步驟非常關(guān)鍵，溶解不好會(huì )導致細胞因子或重組蛋白的活性降低或喪失，這也是許多客戶(hù)經(jīng)常遇到的問(wèn)題。

那么應該如何進(jìn)行正確的溶解呢？

下面以Recombinant Human IL-4（重組人IL-4，產(chǎn)品編號：200-04）的說(shuō)明書(shū)（COA）為例，對細胞因子或蛋白的溶解方法進(jìn)行詳細的闡述。

拿到重組人IL-4的說(shuō)明書(shū)后，您會(huì )發(fā)現有一段關(guān)于Reconstitution（重懸）的敘述，這段內容含有溶解相關(guān)的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening

第 1 步：開(kāi)蓋前離心試劑管

PeproTech 的細胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中，為無(wú)菌包裝。凍干粉在運輸過(guò)程中可能會(huì )因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開(kāi)塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過(guò)離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉全部溶解。

有很多用戶(hù)會(huì )問(wèn)一個(gè)問(wèn)題，即應該用多少轉速、多長(cháng)時(shí)間離心試劑管，才能達到良好的收集效果？

答：有些小型高速離心機（多為進(jìn)口品牌）的面板上有一個(gè) Spin 鍵，按了此鍵后，離心機會(huì )自動(dòng)快速上升到其最大速度(10000rpm 或 12000rpm)，上升到最高點(diǎn)后速度即刻下降，直至停止旋轉，整個(gè)過(guò)程大約 30s。這個(gè) Spin 鍵足以很好的將細胞因子或蛋白收集到管底。

但有些實(shí)驗室沒(méi)有這樣的高速離心機，只有最高轉速為 4000-4500rpm 的離心機。這種情況下，需 3000-3500rpm 離心 5min，也能達到類(lèi)似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do not vortex.

第 2 步：用無(wú)菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml ，不可振蕩。

這個(gè)步驟即為溶解步驟，非常重要。

1）一定要用推薦的溶液重懸（或溶解）凍干粉

用于溶解細胞因子或蛋白的溶液千差萬(wàn)別。此例中的重組人 IL-4 需用水溶解，而重組人 IL-2 （產(chǎn)品編號：200-02）則需用 100mM Acetic Acid （醋酸）溶解，重組人TGF-beta1 （產(chǎn)品編號：100-21）需用 10mMCitric Acid（檸檬酸），pH3.0 溶解，重組人FGF-basic（產(chǎn)品編號：100-18B）需用 5mMTris，pH7.6 溶解，重組人FGF-10（產(chǎn)品編號：100-26）需用5mMSodium Phosphate（磷酸鈉），pH7.4 溶解，重組IL-13（產(chǎn)品編號：200-13）需用 20mMMHCl溶解。（注：即使同一重組細胞 因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的敘述僅供參考。 具體應該如何溶解應以相應批次的說(shuō)明書(shū)為準）。

經(jīng)常會(huì )有客戶(hù)問(wèn)，為什么有多種溶解方法？

答：我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是 pH 值和離子強度。PeproTech 的細胞因子或重組蛋白在出廠(chǎng)前均經(jīng)嚴格測試，說(shuō)明上所標明的溶解液是能夠將該細胞因子或重組蛋白全部溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH 值和離子強度與說(shuō)明書(shū)中所標明的不符，很多時(shí)候會(huì )造成細胞因子或重組蛋白不能全部溶解或者根本無(wú)法溶解，這樣所配得的細胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。

有不少用戶(hù)沒(méi)注意說(shuō)明書(shū)上的描述，而是根據習慣，直接用 PBS 或培養液（1640或 DMEM等)等溶解細胞因子或蛋白的凍干粉。這樣做可以嗎？

答：有時(shí)可以，要看具體情況。PeproTech 的大多數細胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是 PBS，此時(shí)千萬(wàn)不能用 PBS 或培養液直接來(lái)溶解，具體原因在上面已經(jīng)敘述過(guò)。而有部分細胞因子，如重組人 KGF(產(chǎn)品編號：100-19)和重組人FGF-23(產(chǎn)品編號：100-52)等，說(shuō)明書(shū)上的溶解液即為 1x PBS，此時(shí)用 PBS溶解也沒(méi)問(wèn)題，那么用培養液溶解也是可以的，不過(guò)最好還是用先用 PBS溶解，然后再用培養液稀釋。

2）一定要溶解到給的濃度。

蛋白在一定的濃度范圍內可以保持良好的穩定性，這個(gè)范圍就是說(shuō)明書(shū)上所標明的濃度范圍，該例為 0.1-1.0 mg/ml。這個(gè)濃度范圍對于不同的細胞因子或重組蛋白是不同的。如重組人FGF-6（產(chǎn)品編號：100-30）為 0.5-1.0mg/ml，而重組人Activin B（產(chǎn)品編號：120-15）則一定要是0.5mg/ml。

高于或低于該濃度范圍會(huì )有什么問(wèn)題呢？

答：首先，細胞因子或蛋白會(huì )不穩定，即很容易出現活性下降的現象。其次，高于這個(gè)濃度范圍，可能會(huì )超過(guò)該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無(wú)法全部溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會(huì )出現聚集（aggregation），最終結果還是部分蛋白未溶解，導致蛋白活性的減弱。

3）一定不能振蕩(vortex)。

這里所說(shuō)的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩。

有用戶(hù)會(huì )問(wèn)，若想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實(shí)現細胞因子或重組蛋白的全部溶解，該怎么辦呢？

答：多數細胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細胞因子或重組蛋白全部溶解。對于不易溶解的細胞因子或蛋白，PeproTech 會(huì )在說(shuō)明書(shū)中進(jìn)行備注（Note）。如在重組人 IL-13（產(chǎn)品編號：200-13）的說(shuō)明書(shū)中您會(huì )看到：Slow to dissolve （緩慢溶解），在重組人 IL-11（產(chǎn)品編號：200-11）的說(shuō)明中會(huì )看到：This solution is slow to dissolve.（該溶液溶解緩慢）。這種情況下，您最好能將要溶解的細胞因子或重組蛋白放在水平搖床（shaker）上低速搖一段時(shí)間，促使細胞因子或重組蛋白全部溶解。有些蛋白，如重組人 IL-13 Variant （產(chǎn)品編號：200-13A）雖然難溶，但卻不需用搖床來(lái)加速溶解。其說(shuō)明書(shū)上的備注為：Allow the reconstituted vial to sit at 4℃ for at > 2 hours before use.（將重懸液在 4℃靜置2小時(shí)以上）。

The solution can be stored at 2-8℃ for up to one week.

第3步：該重懸液在2-8℃最長(cháng)可保存1周。

用說(shuō)明書(shū)上推薦的溶液重懸細胞因子或重組蛋白至推薦的濃度后，可置于2-8℃儲存，在此條件下其活性最長(cháng)可保持1周。這對于周期為5-7天的實(shí)驗，如DC（樹(shù)突狀細胞）的誘導成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細胞因子或重組蛋白重懸液加入到培養體系即可。一般說(shuō)明書(shū)上推薦的重懸濃度要高于實(shí)驗時(shí)使用的濃度，此時(shí)可能需要對重懸后的溶液進(jìn)行稀釋。如需進(jìn)行稀釋?zhuān)仨氉裱?步中的方法要求，使用含載體蛋白的溶液進(jìn)行稀釋。否則稀釋后的細胞因子或重組蛋白很容易粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中細胞因子的或重組蛋白的濃度下降，總的蛋白活性大為減弱。

For extended storage, it is recommended to further dilute in a buffer containing a carrier protein(example 0.1% BSA) and store in working aliquots at -20℃ to -80℃。

第4步：如果要長(cháng)期保存，需使用含載體蛋白（如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA）的溶液進(jìn)一步稀釋?zhuān)缓蠓盅b凍存于-20℃至-80℃。

如果實(shí)驗周期長(cháng)于一周，或配制的細胞因子或蛋白一次用不完，則需對細胞因子或重組蛋白進(jìn)行長(cháng)期保存。方法：將已重懸的細胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA（牛血清蛋白），10% FBS（胎牛血清），5% HSA（人血清白蛋白）的溶液進(jìn)一步稀釋?zhuān)缓蠓盅b凍存于-20℃至-80℃。

經(jīng)常有客戶(hù)使用COA上推薦的溶液重懸細胞因子或重組蛋白凍干粉后不使用含載體蛋白的

溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)侵苯臃盅b凍存于-20℃至-80℃，這樣可以嗎？

答：不可以的。我們知道塑料管壁對多數蛋白均具有很好的吸附作用，也就是說(shuō)溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后，蛋白是很難與管壁分離的，例如ELISA的包被抗體（Capture antibody）就是通過(guò)這種粘附作用包被到酶標板上的。

載體蛋白，如0.1% BSA（牛血清蛋白），10% FBS（胎牛血清），5% HSA（人血清白蛋白）的主要作用是預先封閉塑料管壁上的蛋白結合位點(diǎn)，使細胞因子或重組蛋白不會(huì )粘附于管壁。如果在細胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后不用含載體蛋白的溶液進(jìn)一步稀釋?zhuān)苯臃盅b凍存，則溶液中的大部分細胞因子或重組蛋白均會(huì )粘附到管壁上，導致溶液中實(shí)際溶解的細胞因子或重組蛋白濃度大為降低，最終表現為細胞因子或重組蛋白活性下降。因此，在分裝凍存時(shí)，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋。稀釋后的細胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因為大量的載體蛋白可以保證任意濃度細胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩定性。一般情況下，推薦的稀釋倍數是原重懸濃度的5-10倍，稀釋后的細胞因子或重組蛋白的濃度不低于10 ug/ml。

那么，含載體蛋白的溶液是什么溶液呢？水可以嗎？

答：水是不可以的。該溶液通常是指pH接近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如PBS，培養液（RPM1640，DMEM等）等。

還有一個(gè)經(jīng)常被問(wèn)及的問(wèn)題，即在做無(wú)血清培養或動(dòng)物體內實(shí)驗時(shí)，細胞因子中不能含有

BSA、FBS或HSA等動(dòng)物或人的蛋白，想要長(cháng)期保存細胞因子或重組蛋白應該怎么辦呢？

答：一種方法是訂購Peprotech的小包裝（Size A）細胞因子或重組蛋白，每次使用一支，用后即廢棄。如覺(jué)得此方法過(guò)于浪費，可使用5%海藻糖（Fucose）作為載體，用含海藻糖的溶液來(lái)稀釋已經(jīng)重懸的細胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。