IDT寡核苷酸合成領(lǐng)域的翹楚----CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

美國Integrated DNA Technologies公司（以下簡(jiǎn)稱(chēng)IDT）創(chuàng )辦于1987年，是寡核苷酸合成領(lǐng)域的翹楚，在過(guò)去的30多年里IDT致力于為學(xué)術(shù)研究、農業(yè)發(fā)展、醫療診斷、藥物研發(fā)等領(lǐng)域開(kāi)發(fā)和制造核酸產(chǎn)品，IDT可以為客戶(hù)提供高品質(zhì)的產(chǎn)品、專(zhuān)業(yè)的技術(shù)支持和個(gè)性化的定制服務(wù)。在分子生物學(xué)領(lǐng)域，IDT為二代測序、基因編輯、qPCR和RNA干擾等領(lǐng)域開(kāi)發(fā)了一系列專(zhuān)有技術(shù)。IDT生產(chǎn)的GMP級別產(chǎn)品被廣泛應用于多種癌癥以及遺傳和感染性疾病的診斷試劑研發(fā)，并通過(guò)不斷優(yōu)化自動(dòng)化合成平臺的處理技術(shù)來(lái)加快原研試劑的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)。
       IDT為100多個(gè)國家和地區的超過(guò)120,000名生命科學(xué)研究人員提供服務(wù)，每天生產(chǎn)70,000多條核酸產(chǎn)品。IDT針對基因組學(xué)應用開(kāi)發(fā)的創(chuàng )新工具和解決方案正在打破研究壁壘，激發(fā)您的夢(mèng)想，實(shí)現下一個(gè)突破。

一、CRISPR/Cas9系統介紹

       CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一種來(lái)自細菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統共分成3類(lèi)，其中Ⅰ類(lèi)和Ⅲ類(lèi)需要多種CRISPR相關(guān)蛋白（Cas蛋白）共同發(fā)揮作用，而Ⅱ類(lèi)系統只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應用提供了便利條件。目前，來(lái)自Streptococcus pyogenes的CRISPR/Cas9系統應用最為廣泛。

       Cas9蛋白（含有兩個(gè)核酸酶結構域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然后通過(guò)PAM序列結合并侵入DNA，形成RNA-DNA復合結構，進(jìn)而對目的DNA雙鏈進(jìn)行切割，使DNA雙鏈斷裂。

      研究人員為了將CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)展為高效的基因打靶工具，又進(jìn)行了優(yōu)化和改造。Cong, L.等人[1]在不影響系統效率的情況下，將crRNA和tracrRNA融合為一條RNA。通過(guò)這種簡(jiǎn)化，CRISPR/Cas9系統現僅包括兩個(gè)元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。因此現在人們將CRISPR/Cas9技術(shù)也稱(chēng)為Cas9/sgRNA技術(shù)。

? 相關(guān)名詞解釋與作用

CRISPR：成簇間隔短回文序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)；
crRNA： (CRISPR RNA)用于識別基因組序列；
tracrRNA： (trans-acting crRNA)用于招募和激活Cas9；
Cas9蛋白：CRISPR-associated genes家族的一員，用于切割DNA，（CRISPR-associated genes家族，包括Cas1、Cas2、Cas4和效應蛋白如Cas9、Cpfl等?？衫闷涔ぷ鳈C制切割特定DNA片段，從而進(jìn)行基因編輯。
 該系統非常高效，因此crRNA只需要最少的設計工作。需要提供的是一個(gè)與您靶基因中的PAM（前間區序列鄰近基序；NGG）序列緊鄰的、具有位點(diǎn)特異性的19或20個(gè)堿基的序列。注：NGG 代表AGG,TGG,GGG,CGG四種可能，滿(mǎn)足其中一種即可。

        總結：crRNA+tracrRNA都是直接得到最佳！

4、輔助試劑

⑴ Purified carrier DNA，通過(guò)電穿孔提高Cas9核糖核蛋白(RNP)的遞送。專(zhuān)門(mén)設計來(lái)避免與人類(lèi)、小鼠和大鼠基因組的同源性

⑵ 小分子化合物，可以提高同源定向修復的比率

⑶g of plasmid.

四、IDT基因編輯關(guān)聯(lián)產(chǎn)品
 

1.Ultramar® 合成

IDT 采用耦合技術(shù)，Ultramer® DNA 合成的耦合效率在行業(yè)中成為第一，具備生產(chǎn)長(cháng)達200 bases 單鏈DNA 的能力。每條Ultramer® DNA 序列都會(huì )通過(guò)ESI-MS 進(jìn)行質(zhì)檢。

圖. 耦合效率決定序列合成終產(chǎn)物全長(cháng)序列的比例、如上圖所示，Ultramer® 優(yōu)勢在合成長(cháng)序列時(shí)尤為明顯。合成200個(gè)堿基的序列時(shí)，在耦合效率為98.5%的工業(yè)標準下，正確合成全長(cháng)產(chǎn)物比例僅為5%；而耦合效率為99.5%（Ultramer® 技術(shù)）時(shí)約高達38%。高耦合效率可以保證完整準確的全長(cháng)序列。

2. HDR Donor Oligos

lt-R™ HDR Donor Oligos旨在增加在基因組編輯實(shí)驗中homology-directed repair（簡(jiǎn)稱(chēng)HDR，是細
胞內一種修復DNA雙鏈損傷的機制）的修復率。

這些定制的產(chǎn)品會(huì )利用專(zhuān)有的修飾來(lái)合成以增加donor oligo的穩定性，從而提高基因組雙鏈斷裂后成功組合進(jìn)基因組的機會(huì )。

• 最長(cháng)200個(gè)堿基
• 經(jīng)過(guò)修飾的單鏈DNA donor oligo
• 3-5天即可發(fā)貨
• 兩種規格可選 2 nmol 或者 10 nmol（可根據客戶(hù)要求提供大包裝）

IDT同樣會(huì )在網(wǎng)站上發(fā)布新的HDR設計工具。工具能夠提供多種不同的輸入方式用于選擇需要編輯的靶標基因組序列，工具包含一個(gè)直觀(guān)的界面，可在編輯區域內進(jìn)行所需的序列編輯。一旦研究者提供編輯內容及編輯位點(diǎn)的詳細說(shuō)明，這個(gè)工具將會(huì )提供推薦的CRISPR-Cas9 guide RNAs 和相應的HDR donor oligos。在重新核查后，客戶(hù)可以輕松下單，并且能夠根據需求創(chuàng )建新的基因組變更項目。HDR設計工具同樣支持適用于更長(cháng)基因組變更的Megamer單鏈DNA片段的訂購。
 

3. Custom Gene Synthesis

IDT提供高質(zhì)量的、序列經(jīng)驗證的人工基因定制合成服務(wù)。定制基因和MiniGene™合成基因使用gBlocks®Gene Fragments或Ultramer® DNA Oligos構建，同時(shí)配以全面質(zhì)控以確?；蛐蛄械臏蚀_性。
質(zhì)量控制和序列驗證
定制基因和MiniGene™基因產(chǎn)品的全部插入片段均在兩條鏈上進(jìn)行序列驗證。通過(guò)Sanger測序進(jìn)行序列驗證；某些情況下，使用MiSeq®系統（Illumina）測序替代Sanger測序。一般情況下，質(zhì)控結果包括色譜圖、質(zhì)粒圖譜和FASTA文件。IDT的基因合成產(chǎn)物終都以質(zhì)粒形式交付，這個(gè)克隆載體可以直接轉化到大腸桿菌中。 為了優(yōu)化生產(chǎn)和交付時(shí)間，長(cháng)度≤5kb的合成基因均插入含有篩選標記的載體，用戶(hù)可根據需要選擇Amp或Kan抗性。 接收到基因產(chǎn)物后，可以使用很多方法將基因序列亞克隆到其他載體中?？寺≥d體的序列和插入位點(diǎn)等信息在隨貨文件中可見(jiàn)。
可應用于
· 蛋白表達
· miRNA 基因
· IVT模板
· 基因變異和SNP分析
 

基因編輯相關(guān)的周?chē)a(chǎn)品

• ·合成基因可選載體

可能影響合成、組裝或測序結果的情況如下

•二級結構：>10個(gè)堿基的發(fā)夾結構和富含G / C的二級結構
•重復序列和同聚序列：長(cháng)重復序列，G / C>10個(gè)堿基，或A/T>30個(gè)堿基
•總體GC含量>65％，區域GC含量<25％
• 限制性位點(diǎn)重復和Dam / Dcm甲基化位點(diǎn)均可能干擾限制內切酶酶切
 
 

4. gBlocks Gene Fragments

gBlocks基因片段是經(jīng)過(guò)序列驗證的，長(cháng)度為125-3000 bp的雙鏈DNA分子片段，采用IDT的Ultramer®DNA Oligos合成技術(shù)。具有高準確性、高性?xún)r(jià)比和應用靈活等特性。
 
 

質(zhì)量控制和序列驗證

•通過(guò)毛細管電泳（ Capillary Electrophoresis ，CE）驗證片段長(cháng)度。
•通過(guò)質(zhì)譜（Mass Spectrometry ）鑒定序列。
•在多數情況下，每個(gè)gBlocks基因片段重組克隆測序后， 80％*之上的克隆都包含期望的插入片段。

* 如果序列非常復雜，其保真度可能會(huì )降低?？梢酝ㄟ^(guò)適當增加測序的克隆數目來(lái)獲得序列正確的插入片段         

可應用于：         

           •基因構建和修飾
           •CRISPR的基因&轉錄形成sgRNA
           •qPCR或PCR的標準品或內參
           •抗體研究，例如制備重組抗體
           •酶工程
           •疫苗研究

5、gBlocks Gene Fragment Libraries

IDT提供含有mixed base的251-500bp的基因片段庫，其優(yōu)勢在于：
•可以接受的成本生成多達數十萬(wàn)的構建變體。

•可以自由選擇克隆載體與克隆方法，包括Gibson Assembly®方法和平端或黏末端等克隆方案，實(shí)現輕松組裝

產(chǎn)品詳情

合成251-500bp中允許出現1-8個(gè)隨機堿基“N"的出現。注：N代表A,T,G,C任意一個(gè)堿基。
 

6、Megamer Single-Stranded DNA

IDT提供長(cháng)度為201-2000個(gè)堿基的Megamer ssDNA片段，Megamer ssDNA經(jīng)克隆純化的DNA生成，因而純度特別高

         可應用于：           

       · CRISPR介導的基因編輯的同源重組（HDR）            

      ·體外轉錄（IVT）等應用中。

五、使用文獻

1.Vakulskas CA, Dever DP,   et al. (2018) A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells
Nat Med. 24:1216- 1224. doi: 10. 1038/s41591-018-0137-0.
2.Park SH, Lee CM, et al. (2018) Highly efficient editing of the beta-globin gene in patient derived
hematopoietic stem and progenitor cells to treat sickle cell disease. Blood, 132(Suppl 1),2192. doi: 10. 1182/blood-2018-99-l 17371.