細胞培養如何應對支原體污染

細胞培養物被支原體污染是極普遍的問(wèn)題，面對支原體污染給細胞培養帶來(lái)的巨大難題，世界各國開(kāi)始重視，并相繼建立了細胞庫，對細胞質(zhì)量進(jìn)展控制，效果很好，支原體污染的問(wèn)題得以限制。目前已知能污染細胞的支原體有20多種以上，其中95％以上的支原體污染是口腔支原體。

目前已知的主要污染源是動(dòng)物血清、胰酶和已污染培養物的氣溶膠，例如，豬鼻支原體通過(guò)胰酶，在消化細胞時(shí)進(jìn)入細胞培養物，并造成污染。在原代細胞與傳代細胞的檢測中，原代細胞與傳代細胞分離出支原體的頻率是有明顯差異的，傳代次數越多的細胞，污染支原體的可能性就越大，這也是多次與動(dòng)物血清、胰酶和已污染培養物的氣溶膠接觸后造成的，在原代細胞中，污染率低于4%，而傳代細胞的污染率則高達57%~92%。

支原體的介紹

支原體是目前已知一類(lèi)能在無(wú)生命培養基上生長(cháng)繁殖的最小的原核細胞微生物，分為兩個(gè)屬：一為支原體屬（Mycoplasma），有幾十個(gè)種；另一為脲原體屬（Ureaplasma），僅有一種。革蘭染色 為陰性，但不易著(zhù)色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。                                                           

支原體在自然界分布廣泛，無(wú)細胞壁，直徑為0.1-0.3μm，且形態(tài)易變，極易通過(guò)除菌過(guò)濾器。大部分支原體繁殖速度比細菌慢，適宜生長(cháng)溫度為35℃，適合于偏堿條件下生存（pH7.6—8.0），

對酸耐受性差，對75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。對熱比較敏感在細胞培養過(guò)程中如果在顯微鏡下發(fā)現破碎 的細胞很多，需要頻繁換液才能維持傳代培養的時(shí)候，即應懷疑支原體污染。細胞培養過(guò)程中遇到的支原體95%都來(lái)自于以下四種支原體：口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無(wú)膽甾支   原體， 其中萊氏無(wú)膽甾支原體為牛源性。                                                                                 

支原體的污染來(lái)源

（1）細胞之間交叉污染；                                                         

（2）細胞培養操作人員的口腔、皮膚等；                                       

（3）工作環(huán)境或實(shí)驗器材的污染；                                               

（4）培養基的污染。                                                      

支原體污染示例圖

支原體污染的嚴重性

（1）細胞外形可以沒(méi)有明顯的變化，支原體可以與細胞共存，污染后細胞液不會(huì )死亡，培養基一般不發(fā)生渾濁；                                                                 

（2）使用被支原體污染的細胞做實(shí)驗會(huì )嚴重影響實(shí)驗的結果，因為支原體會(huì )抑制細胞生長(cháng)；導致染色   體畸變；細胞膜抗原性改變；細胞復蘇后存活率降低等。     

（3）影響細胞的代謝和功能：培液中的精氨酸被支原體大量消耗，引起細胞蛋白質(zhì)、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙；支原體活動(dòng)使培液成分發(fā)生改變（如發(fā)酵型支原體降解糖類(lèi)產(chǎn)生酸性物質(zhì)），影響細胞代謝。

（4）培養過(guò)程中細胞破碎較多，培養基pH變化明顯，需要頻繁更換新鮮培養基；       

（5）細胞被支原體污染后會(huì )形成共生體系導致污染不斷擴大。               

支原體污染的檢測及鑒定方法：

01

分離培養法

支原體的病原學(xué)檢測主要是從被污染的細胞、雞胚中分離培養出支原體來(lái)確定，分離培養法是檢測支原體污染中最為可靠準確的方法。但是支原體對環(huán)境的影響敏感，容易被滅活，而且分離培養操作相對繁瑣，所需時(shí)間較長(cháng)，因此只能夠對支原體污染進(jìn)行定性觀(guān)察。分離培養法在常規的支原體檢測中多用于輔助其它檢測方法。                                                                                                     

02

DNA熒光染色法

DNA熒光染色法較分離培養法縮短了檢測周期，主要用于細胞培養中污染支原體的檢測。DNA熒光染色法正是利用熒光染色劑雙苯咪唑（Bisbenzimidzole）Hoechst33258能夠結合支原體DNA中的A-T堿基富集區域的原理，被支原體污染的細胞經(jīng)染色后，其細胞核外與細胞周?chē)煽吹皆S多大小均一的熒光點(diǎn)，即是富含A-T堿基區域的支原體DNA。                                                                   

03

PCR技術(shù)

PCR作為一種快速、靈敏、特異且簡(jiǎn)便的基因診斷技術(shù)已應用于科學(xué)研究和疾病的診斷。根據支原體基因組內的保守序列設計特異引物，對待檢樣品的核酸進(jìn)行擴增，通過(guò)對擴增產(chǎn)物的大小分析作出診斷。PCR檢測技術(shù)用于支原體污染的檢測，周期短、靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單且一次可檢測大量樣品。                                                                                                                               

04

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA用于支原體污染的檢測中，有著(zhù)良好的特異性和敏感性，一次可以完成大量樣品的檢測。如今已有LONZA等公司開(kāi)發(fā)了針對細胞中污染支原體的檢測試劑盒，具有簡(jiǎn)便、快速與定量定性檢測等特點(diǎn)。                                                                                                                                 

05

電鏡

一般在細胞培養48～72小時(shí)，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀(guān)察。                                                                                                 

06

定期檢測

支原體感染會(huì )使培養細胞慢慢枯萎，因此對培養細胞定期進(jìn)行支原體檢測非常重要。一般來(lái)說(shuō)每1至3個(gè)月就應該進(jìn)行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規化堅持下去，是細胞培養實(shí)驗室應對支原體感染的關(guān)鍵。                                                                                                                     

細胞污染支原體的預防

細胞培養工作中，主要從以下幾個(gè)方面來(lái)預防支原體的污染：                                           

1）控制環(huán)境污染                                                           

2）嚴格實(shí)驗操作                                                                   

3）細胞培養基和器材要保證無(wú)菌                                                    

4）在細胞培養基中加入適量的抗生素                                               

　　支原體污染細胞后，有必要清除支原體，常用方法有：                         

1）對于非重要的細胞，如培養中的細胞、WCB的細胞等，將培養物與用過(guò)的培養基滅活后丟棄即可。對于較為重要的細胞，如來(lái)源珍貴或實(shí)驗室中細胞保藏量較小等可以采用以下（2）-（8）的方法。                                                             

2）用MRA處理：用支原體清除劑（Mycoplasma Removal Agent）處理細胞，作用濃度為  25μg/ml，兩周可以清除支原體。                             

3）用清洗純化法清除支原體污染的方法：細胞營(yíng)養馴化→優(yōu)質(zhì)細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌，其原理是利用離心力、細胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過(guò)反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數量降低至很少. 如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。                                         

4）藥物輔助加溫處理：先用藥物處理后，再將污染的組織培養物放在41℃培養18小時(shí)，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。                                           

5）使用支原體特異性血清：用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長(cháng)，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。                     

6）動(dòng)物體內接種除菌法：把受支原體污染的腫瘤細胞接種在同種動(dòng)物皮下或腹腔中，借動(dòng)物免疫系統消滅支原體，而腫瘤細胞卻能在體內繼續生長(cháng)，待一定時(shí)間后，從體內取出細胞再進(jìn)行培養繁殖。     

7）巨噬細胞吞噬法：從動(dòng)物腹腔采取巨噬細胞，為排除其它細胞成分，可先進(jìn)行純化，然后再加入被支原體污染的細胞培養液中混合培養。在培養過(guò)程中，為檢查支原體是否已被消除干凈，可利用支持物培養法驗證，取出支持物逐日染色、鏡檢觀(guān)察，至支原體已被消除干凈為止。                                 

8）使用支原體清除培養基，每2~3天更換1次新鮮培養液，換液時(shí)用無(wú)菌的平衡鹽溶液洗滌細胞1~2次；期間如果細胞密度過(guò)大，請保持細胞密度適當（貼壁細胞可能需要用胰酶消化），并更換新的培養器皿，3天之后，即可見(jiàn)明顯清除效果；處理15天后，可以用支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測支原體是否殺滅全部；如果仍有支原體殘留，可以考慮再處理6天；為避免細胞再次受到“支原體"的污染，以后每隔1個(gè)月進(jìn)行支原體的常規檢測，以保證沒(méi)有新的支原體污染。                                           

注：支原體污染時(shí)細胞表現為長(cháng)得不好，也不死亡，同時(shí)，培養基又是清亮的，時(shí)間長(cháng)達一周也沒(méi)有什么變化，這時(shí)基本上可以判斷出是支原體污染了。