Cellmax-細胞克隆形成實(shí)驗

實(shí)驗原理

細胞克隆形成實(shí)驗是用來(lái)檢測細胞增殖能力、侵襲性、對殺傷因素敏感性等項目的重要技術(shù)方法。

當單個(gè)細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體，成為集落或克隆。其中細胞克隆形成率即細胞接種存活率，表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數量。

貼壁后的細胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。

克隆形成率反映細胞群體依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。

克隆形成的目的

1）通過(guò)對細胞處理后在細胞培養板上的克隆形成能力來(lái)提示處理后細胞的增殖能力。

2）評價(jià)不同殺傷因素(藥物、基因等)對腫瘤細胞增殖能力或群體依賴(lài)性的敏感性;

3）評價(jià)細胞在體內成瘤性，癌細胞不一定都可以在體內成瘤，但若體外克隆能力越強，即表明體內成瘤性越強，算是一種模擬體內成瘤的體外實(shí)驗。

克隆形成的分類(lèi)

克隆形成依據采用的培養介質(zhì)的不同，分為平板克隆和軟瓊脂克隆兩類(lèi)。

1. 平板克隆形成（Colony formation）：細胞培養在培養基中，應用于貼壁的細胞。

2. 軟瓊脂克隆形成（soft agar colony formation）：細胞被瓊脂糖掛起來(lái)，主要應用于懸浮的腫瘤細胞和轉化細胞系。

下面我們就具體看一下這2種實(shí)驗技術(shù)的具體操作。

01平板克隆實(shí)驗過(guò)程

所需材料

• 基礎培養基（根據細胞選擇適用種類(lèi)）

• 胎牛血清

• 胰蛋白酶

• PBS

• 青霉素-鏈霉素溶液（100X）

• 多聚甲醛固定

• 結晶紫染液

• Giemsa染液

實(shí)驗步驟

一、6孔板

1.將處于對數生長(cháng)期的細胞胰酶消化后，全部培養基（基礎培養基+10%胎牛血清）重懸成細胞懸液，并計數；

2.細胞接種：于6孔板培養板中各實(shí)驗組接種400-1,000個(gè)細胞/孔（根據細胞生長(cháng)情況確定，一般為700個(gè)細胞/孔）;

3.繼續培養到14天或絕大多數單個(gè)克隆中細胞數大于50為止，中途每隔3天進(jìn)行換液并觀(guān)察細胞狀態(tài)；

4.克隆完成后，在顯微鏡下對細胞進(jìn)行拍照，然后PBS洗滌1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗滌1次；

注意事項

1.每隔3天進(jìn)行換液，在換液時(shí)，緩慢加入培養基，避免吹起細胞。

2.染色完成后，務(wù)必將染液清洗干凈，不要在孔中有殘留。

二、平皿

1. 取對數生長(cháng)期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細胞，并把細胞懸浮在全部培養基（基礎培養基+10%胎牛血清）中備用。

2. 將細胞懸液作梯度倍數稀釋?zhuān)拷M5個(gè)平行樣。每組細胞每皿分別接種100個(gè)細胞于含10ml 37℃預溫培養液的皿中，并輕輕轉動(dòng)，使細胞分散均勻。

3. 置37℃、5% CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養2～3周。

4. 當培養皿中出現肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。

5. 加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分鐘。

6. 去固定液，加適量Giemsa應用染色液染10～30分鐘

7. 用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

8. 將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數大于10個(gè)細胞的克隆數。最后計算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%

DU145細胞克隆形成的圖片（相機左，顯微鏡右）

注意事項

平板克隆形成實(shí)驗方法簡(jiǎn)單，適用于貼壁生長(cháng)的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。

實(shí)驗成功的關(guān)鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過(guò)大。

數據分析

顯微鏡下觀(guān)察陽(yáng)性克隆，即每個(gè)克隆>50個(gè)細胞，相機拍照，數克隆數（大小約在0.3-1.0 mm）計算克隆形成率，并統計克隆大小。

例：如研究某個(gè)基因對細胞增殖的影響，敲低前列腺癌細胞株P(guān)C3的TCTN1基因，顯微鏡下拍照（Scale bar=250 μm）和相機拍照，克隆的大小和數量均受到抑制。

02軟瓊脂克隆形成

軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴(lài)性生長(cháng)實(shí)驗Anchorage-independent assay，利用軟瓊脂為培養介質(zhì)，使細胞在懸浮狀態(tài)下生長(cháng)。

某些惡性腫瘤細胞，不僅在貼壁狀態(tài)下能增殖，在懸浮狀態(tài)下也能增殖，進(jìn)而通過(guò)軟瓊脂中形成克隆的能力反映了惡性程度，可用于細胞分化的基礎研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗等方面。

1. 具體過(guò)程：如下圖所示   

1. .配制1.2% 和0.7%瓊脂，高壓滅菌后，維持在42℃中使其不會(huì )凝固；

2. 將1.2% 瓊脂與2×培養基混合，鋪入6孔板作為下層膠，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；

3. 將制備好的單細胞懸液與0.7%瓊脂充分混勻，加入6孔板作為上層膠，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培養基，每3天更換一次；

4. 根據細胞的生長(cháng)速度培養2~3周后顯微鏡下觀(guān)察克隆大小，與平板克隆一樣，每個(gè)克隆>50個(gè)細胞，顯微鏡拍照。若拍整個(gè)孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑藍（NBT）染色，37°C過(guò)夜，拍照。

2. 數據分析：顯微鏡或相機拍照，計算克隆形成率

例：通過(guò)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗檢測ME2蛋白對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞生長(cháng)的影響。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞GBM8401中將ME2蛋白敲低，形成的克隆數減少。

注意事項

1.上層軟瓊脂使細胞分散成單個(gè)，下層軟瓊脂作為支撐防止細胞貼附生長(cháng)。最后鋪上一層培養基是為了防止膠干燥，并給細胞補充營(yíng)養，如果做藥物處理，則在培養基中加入藥物。

2.上層膠細胞數目根據不同的細胞類(lèi)型而定。一般以5000個(gè)細胞/孔作為起始濃度，根據需要調整。

3.瓊脂放入水浴鍋中維持在42℃左右。溫度過(guò)低瓊脂凝固，在做基底時(shí)瓊脂凝固過(guò)快會(huì )導致不均一，溫度過(guò)高則會(huì )將細胞燙死。此外，實(shí)驗過(guò)程中速度要快，防止局部結塊。

結語(yǔ)

2種細胞克隆方式，如何選擇？

根據實(shí)驗對象和目的選擇，平板克隆檢測貼壁腫瘤細胞的增殖能力和致瘤性，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗除了檢測貼壁細胞，還能檢測懸浮腫瘤細胞和轉化細胞系，具有平板克隆不可取代的優(yōu)勢。若只是簡(jiǎn)單評價(jià)貼壁細胞的增殖能力和群體依賴(lài)性，則選擇平板克隆即可。

北京和一生物科技有限公司專(zhuān)業(yè)代理antibodiesinc全系列產(chǎn)品，專(zhuān)營(yíng)進(jìn)口生物試劑，科學(xué)儀器，實(shí)驗消耗品，化工原料及藥物中間體等。公司與諸多國外品牌簽下代理，sigma、santa、RD、Abcam、CST、toxin、streck、Biolegend、ebioscience、saracare、polyplus、Beyotime、Novus、moltox等，能為廣大科研用戶(hù)提供數萬(wàn)種試劑、儀器和實(shí)驗消耗品。

我們公司的優(yōu)勢:

1：與500多家公司合作，基本什么品牌都能進(jìn)口，包括血清，抗體，耗材，還有部分限制進(jìn)口的

2：部分產(chǎn)品現貨，物流穩定

3：一手貨源，價(jià)格價(jià)格優(yōu)，售后齊全，歡迎新老客戶(hù)咨詢(xún)訂購