WB，IP，IHC，IF，ChIP，FC所用的抗體有什么區別？

生物醫學(xué)科研工作者的科研基本離不開(kāi)抗體，WB（western blot）,IP(immunoprecipitation), IHC(immunohistochemical 免疫組化),IF(immunofluorescence 免疫熒光),ChIP(Chromatin immunoprecipitation)，FC(flowcytometry 流式細胞) 都需要用到抗體，那么這幾種實(shí)驗方法中的抗體有什么區別呢？

我們在CST上面找p53的抗體，得到了如下的頁(yè)面

可以看出p53抗體有很多種，并且每種抗體能做的實(shí)驗還都不一樣，那么為什么不同的抗體能做的實(shí)驗不一樣呢？這要從抗體是如何制備的開(kāi)始。

1. 如何才能成為一個(gè)優(yōu)秀的抗原？

制備抗體之前最重要的是如何制備抗原。一個(gè)良好即優(yōu)秀的抗原應該具備的素質(zhì)是

a. 分子足夠大。 我們知道抗原與抗原之間的區別是由抗原決定族決定的，抗原決定族又叫做表位（epitope），這些表位通常是由6-8個(gè)氨基酸組成的。而且要5-10kD才有一個(gè)表位，所以一些分子量太小的蛋白質(zhì)或者多肽很難有一個(gè)表位的，也很難作為一個(gè)合格優(yōu)秀的抗原。注意表位有兩種形式，一種是線(xiàn)性表位，即由氨基酸的序列決定的。另外一種是構象表位，是由氨基酸的空間結構決定的。兩個(gè)相隔很遠的氨基酸序列在空間結構上靠在一起可以形成一個(gè)結構表位。

b. 外源性強。我們常常將抗原注射到動(dòng)物內體得到抗體，因此抗原必須要與該動(dòng)物體內的成分區別性大，因為動(dòng)物對自身的物質(zhì)形成了免疫耐受，如果抗原與動(dòng)物自身的物質(zhì)非常相似，則很難引起強烈的免疫應答，也很難得到好的抗體。

c. 結構盡量復雜。有些物質(zhì)即使分子量很大也不能算是一個(gè)合格的抗原，比如明膠分子量特別大，也屬于外源性強的物質(zhì)。但是明膠的氨基酸基本上是直鏈的氨基酸，在體內容易被降解，類(lèi)似的淀粉、核酸、多聚賴(lài)氨酸也是一樣，不是一個(gè)合格的抗原。

2. 制備抗體中常用獲得抗原的方式有哪些？

a. 人工合成多肽。很多家族蛋白相似度很高，比如actin家族中 a-actin, b-actin, r-actin三者之間非常相似，基本上只差幾個(gè)氨基酸，而這些差別的氨基酸往往還被包裹在內部。因此只有人工合成這些差別的序列多肽，才可能區分開(kāi)這三種相似的蛋白質(zhì)。制備出來(lái)的抗體大部分是識別線(xiàn)性結構的蛋白質(zhì)。

b. 純化的重組蛋白。重組蛋白比較容易獲得，而且能夠獲得比較高的純度。但是在重組蛋白中我們?yōu)榱思兓尤胍欢螛撕灒ū热?/span>GST， His, Flag等），拿這些帶有標簽的重組蛋白去免疫動(dòng)物，自然也會(huì )得到對標簽識別的抗體。我們常常用His作為標簽，因為它比較小，而且免疫原性比較弱，產(chǎn)生的抗體可以忽略。制備的抗體可以識別線(xiàn)性結構的蛋白質(zhì)，也可以識別天然折疊狀態(tài)下的蛋白質(zhì)。

c. 純化的天然蛋白。天然蛋白存在修飾，結構復雜，因此是用來(lái)做抗體zui 好的抗原。但是很遺憾天然蛋白很難達到較高的純度。制備出來(lái)的抗體*是識別天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，對線(xiàn)性結構的也能識別。

3. WB，IP，IHC，IF，ChIP，FC之間對抗體需求有什么區別？

在理解上面技術(shù)對抗體需求的區別之前我們首先要知道這些實(shí)驗技術(shù)都需要什么樣的抗體。

a. WB. WB的蛋白經(jīng)過(guò)加熱變性之后都變成線(xiàn)性的結構。因此zui 好的抗體是采用非常特異序列的人工合成多肽的方法來(lái)做實(shí)驗，結果也非常特異。

b. IP/CHIP. 我們用抗體去結合生理狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，因此IP的抗體最好使用純化的天然蛋白制作的抗體來(lái)做，也可以用純化的重組蛋白的抗體。最好不要用人工合成多肽制作的抗體，因為這種抗體識別的位點(diǎn)可能被深深地藏在了蛋白的內心深處。CHIP和IP沒(méi)有太大的區別，wei一的問(wèn)題在于，如果抗體識別的表位和該蛋白質(zhì)與DNA結合的部位一致，則會(huì )導致CHIP實(shí)驗的失敗。

c. IF/IHC. 免疫熒光和免疫組化中需要進(jìn)行固定一步，固定是為了盡量讓細胞的形態(tài)結構維持和原有的一致。這種化學(xué)物質(zhì)的固定使蛋白質(zhì)變性凝固，與天然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)有了一定的區別，但是又不同WB中加熱變性變成了線(xiàn)性的結構。因此在做IF/IHC實(shí)驗中，最合適的抗體可以是純化的重組蛋白得到的抗體，也可以是人工合成多肽得到的抗體（多肽是在蛋白質(zhì)的表面）

d. FC. 流式細胞中分為兩種，一種是活細胞的流式，這種流失最好采用是天然蛋白或者重組蛋白的抗體來(lái)做，另外一種是經(jīng)過(guò)固定之后的流式，和IF/IHC 所用抗體一致。 在做流式細胞中，我們有直接標記和間接標記，間接標記不如直接標記真實(shí)準確。因此我們選擇流式抗體要采用帶有熒光標記的抗體；如果研究的蛋白沒(méi)有直接標記的抗體，那么就采用間接標記抗體，需要添加熒光二抗。

4. 常見(jiàn)的問(wèn)題

a. 做流式的抗體和免疫組化的抗體是一樣的嗎？

不一定能通用。流式是用直接標記還是間接標記？如果是直接標記的話(huà)，那這個(gè)抗體一般不是FITC標記或者就是TRITC，PE之類(lèi)的。如果恰好你的免疫組化，也是想用熒光素標記的抗體來(lái)直接標記，那就可以通用。如果你的免疫組化要用其它的標記的話(huà)，或者是間接標記的話(huà)，就有麻煩，因為熒光素的標記很可能會(huì )影響二抗和一抗的結合。

b. 為什么我的抗體做WB非常好，而做不了IF，IHC等其他任何實(shí)驗？

首先恭喜你有一個(gè)WB非常好的抗體，畢竟能獲得做WB非常好的抗體也不容易。其次，你這個(gè)抗體很可能是通過(guò)人工合成多肽得到的，和上面所述，你用來(lái)做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白質(zhì)的中心，因此只能識別WB中線(xiàn)性的部分。

c. 如何選擇免疫組化抗體？

首先，一抗是選擇單克隆抗體還是多克隆抗體，單克隆抗體特異性強，靈敏度低；多克隆抗體靈敏度高，特異性弱。根據你的實(shí)驗結果，如果非特異多，那么選擇單克隆抗體；如果陽(yáng)性信號弱，不妨選擇多克隆抗體試試。一般家兔來(lái)源的都是多克隆，小鼠來(lái)源的是單克隆。其次是要弄明白該一抗能夠識別什么種屬的抗原，抗體說(shuō)明書(shū)上面一般注明有，比如小鼠Mus, 大鼠Rat, 人Hum。再次比較重要的是要注意一抗的來(lái)源。比如我們在人的癌組織中做p53的免疫組化，一抗我們采用的是小鼠來(lái)源的p53抗體，那么二抗我們一定要選擇 抗小鼠的二抗比如（山羊抗小鼠，兔抗小鼠），這一點(diǎn)非常重要。最后，一般的抗體說(shuō)明書(shū)都會(huì )注明能做什么實(shí)驗，如果標明了不可以做免疫組化，一定不要選擇；反過(guò)來(lái)說(shuō)，即使標明了可以做免疫組化，也不一定能夠做，商家只會(huì )夸大其效果。

d. WB和IF的二抗是一樣的嗎？

很明顯，不是！免疫熒光抗體是用于 免疫熒光試驗的，是用FITC或PE等標記的抗體，結果需要紫外線(xiàn)激發(fā)并用熒光顯微鏡觀(guān)察WB抗體一般是HRP或堿性磷酸酶等標記的抗體，需顯色底物（如OPD\TMB等）直接顯色（肉眼）或化學(xué)發(fā)光法顯影（需特殊儀器）。

e. 做CHIP的抗體是否可以用來(lái)做WB抗體？

不一定，一般來(lái)說(shuō)做CHIP級別的抗體對抗體純度特異性方面都要求比較高，基本上能做CHIP的抗體都可以做WB。但是如果CHIP的抗體識別的是構象表位（比如是由兩個(gè)實(shí)際靠在一起但變?yōu)榫€(xiàn)性結構之后相隔很遠的兩端序列），而不是線(xiàn)性表位，這種CHIP抗體做不了WB。

f. 抗體說(shuō)明書(shū)上面沒(méi)有寫(xiě)該抗體能夠用于某項實(shí)驗怎么辦？

一般而言，抗體研發(fā)出來(lái)之后都要經(jīng)過(guò)WB，IP，IF，IHC實(shí)驗。檔發(fā)現濃度不夠做IF，IHC時(shí)候，國外的抗體一般都是寫(xiě)未檢測，國內的抗體一般是不寫(xiě)。所以盡量不要抱著(zhù)試試的心里去嘗試，往往只會(huì )浪費時(shí)間。你想啊，如果抗體能夠做該實(shí)驗，他們肯定會(huì )寫(xiě)上去啊。

g. 做ELISA的抗體能否用來(lái)做WB？

通常用WB抗體稀釋濃度為1:1000，IF/IHC為1:100，而如果可以做ELISA則可以稀釋1:10000。如果一個(gè)抗體用來(lái)做ELISA的，那么言外之意就是該抗體效價(jià)不高。但不是說(shuō)ELISA的抗體不能用于做WB，抗體說(shuō)明書(shū)提示做ELISA稀釋比例為1:1000，那么你可以試試1:100做做WB。