如何擺脫qpcr苦惱，得到更好的結果

什么是熒光定量PCR？

指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)
PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見(jiàn)"，最后通過(guò)Ct值和標準曲線(xiàn)對樣品中的DNA(or cDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法。

定量PCR原理？

與傳統PCR一樣,反應在溫度模塊里循環(huán)進(jìn)行；理論上每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)目的基因的數量都會(huì )增加一倍；每個(gè)循環(huán)結束后,定量PCR儀器通過(guò)不同的濾光片記錄熒光信號；在擴增過(guò)程中,熒光信號隨著(zhù)PCR產(chǎn)物的增加而增強。

定量PCR體系？

普通的PCR體系；模板,引物,dNTPs，buffer，Taq酶；加入各種類(lèi)型的熒光染料。

在做Real time PCR時(shí)，對于SYBR Green I染料法和Taqman探針?lè )ǘ伎梢?，但是二者有區別。SYBR Green I染料法是利用SYBR Green I結合雙鏈DNA來(lái)檢測PCR產(chǎn)物，可用于監測任意雙鏈DNA序列的擴增，但是必須考慮非特異性擴增。因成本相對低，是目前較常用的)。但是由于SYBRGreen I可以與所有的雙鏈DNA結合，包括非特異性的雙鏈DNA序列，因此可能會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性信號。

圖1：SYBR染料法原理圖

Taqman探針?lè )ㄊ褂脽晒馓结槞z測PCR擴增過(guò)程中產(chǎn)生的特異PCR產(chǎn)物：特異性熒光信號的產(chǎn)生，需要探針與目標序列進(jìn)行特異性的雜交；探針可以標記不同的報告基團，因此可以在一個(gè)反應管中進(jìn)行二條序列擴增完整的探針。5′端熒光基團吸收能量后將能量轉移給臨近的3′端熒光淬滅基團(發(fā)生熒光共振能量轉移)；退火，探針與模板結合，引物在聚合酶作用下進(jìn)行延伸反應，遇到探針時(shí)發(fā)揮3′-5′外切酶活性將探針切碎到反應體系中；報告基團與淬滅基團距離變大，在激發(fā)光的作用下發(fā)熒光。實(shí)驗結果重復性好，價(jià)格高。

圖2：TaqMan探針?lè )ㄔ韴D

說(shuō)了這么多，不知道小伙伴們對qPCR的理解是不是清晰多了呢?qPCR作為一種簡(jiǎn)單便捷的定量技術(shù)，應該是小伙伴們常用的技術(shù)了。雖然聽(tīng)起來(lái)簡(jiǎn)單但做起來(lái)卻沒(méi)有想象的那么簡(jiǎn)單，事實(shí)上，實(shí)驗室做一個(gè)樣本檢測QPCR需要1~2個(gè)小時(shí)，這個(gè)時(shí)候不僅試劑盒重要，檢測能力也很重要，希望這篇文章能幫助小伙伴們對QPCR有一個(gè)清晰的了解