不同蛋白濃度測定方法優(yōu)缺點(diǎn)

1.    BCA法測定試劑盒

堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò )合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標準曲線(xiàn)對比，即可計算待測蛋白的濃度。不方便的是這種方法需要提前制作標準曲線(xiàn)。BCA蛋白質(zhì)測定方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，試劑及其形成的顏色復合物穩定性俱佳。BCA方法適用于表面活性劑存在下的蛋白質(zhì)濃度檢測，可兼容高達5%的SDS，TritonX-100及Tween等。然而，由于BCA方法依靠銅離子進(jìn)行顯色反應，如果溶液中含有與銅離子反應的螯合劑比如EDTA或者還原性試劑比如DTT、β-巰基乙醇，結果將受到很大程度的影響。同時(shí)，BCA方法的檢測結果也會(huì )受到蛋白質(zhì)內半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸含量的影響。

2.    Bradford法

該方法的原理是，帶負電的考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)中堿性氨基酸相互作用?？捡R斯亮藍在溶液中顯紅色，吸收峰在465nm處，當與蛋白質(zhì)結合后，其顯藍色，在595nm處有吸收峰。595nm處的吸光值與蛋白質(zhì)的濃度呈正比。

Bradford法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。樣品中巰基乙醇的濃度可高達1M，二硫蘇糖醇的濃度可高達5mM。但受略高濃度的去垢劑影響。需確保SDS低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween 20, 60, 80低于0.06%。

3.    UV280法

這種方法是在280nm波長(cháng)，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測試空白液，然后直接測試蛋白 質(zhì)。從而顯得結果很不穩定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受 到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

1）簡(jiǎn)易經(jīng)驗公式

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor 

2）精確計算

通過(guò)計算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過(guò)如下公式計算最終結果：

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D

其中d為測定OD值比色杯的厚度

D為溶液的稀釋倍數

4.    Lowry法

     蛋白質(zhì)在堿性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質(zhì)一銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍色化合         物，在一定條件下，利用藍色深淺與蛋白質(zhì)濃度的線(xiàn)性關(guān)系作標準曲線(xiàn)并測定樣品中蛋白質(zhì)的濃度。

     5、考馬斯亮藍（Coomassie Brilliant Blue）法

考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。

考馬斯亮藍G―250存在著(zhù)兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。它和蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力結合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍         內，蛋白質(zhì)和染料結合符合比爾定律（Beer’s law）。此染料與蛋白質(zhì)結合后顏色有紅色形式和藍色形式，最大光         吸收由465nm變成595nm，通過(guò)測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質(zhì)的量。

蛋白質(zhì)和染料結合是一個(gè)很快的過(guò)程，約2min即可反應*，呈現最大光吸收，并可穩定1h，之后，蛋白質(zhì)―染料復         合物發(fā)生聚合并沉淀出來(lái)。蛋白質(zhì)―染料復合物具有很高的消光系數，使得在測定蛋白質(zhì)濃度時(shí)靈敏度很高，在測定           溶液中含蛋白質(zhì)5µL/ml時(shí)就有0.275光吸收值的變化，比Lowry法靈敏4倍，測定范圍為10-100µg蛋白質(zhì)，微量測定         法測定范圍是1－10µg蛋白質(zhì)。此反應重復性好，精確度高，線(xiàn)性關(guān)系好。標準曲線(xiàn)在蛋白質(zhì)濃度較大時(shí)稍有彎曲，         這是由于染料本身的兩種顏色形式光譜有重疊，試劑背景值隨更多染料與蛋白質(zhì)結合而不斷降低，但直線(xiàn)彎曲程度很         輕，不影響測定。

此方法干擾物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4無(wú)干擾。強堿緩沖液在測定中有一些顏色         干擾，這可以用適當的緩沖液對照扣除其影響。Tris，乙酸，2―巰基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污劑如                Triton X―100，SDS，玻璃去污劑有少量顏色干擾，用適當的緩沖液對照很容易除掉。但是，大量去污劑的存在對           顏色影響太大而不易消除。