1. 配制培養基: DMEM=內酮酸鈉++10%血清++青鏈毒素

2. 復蘇：37度融化后，擦干凍存管酒精擦，細胞加入15m離心管，加5ml培養基500g離心5min,棄上清，加1ml 培養基重懸后加入到培養瓶中，5~6ml左右，記得晃勻。

3. 傳代：吸出舊培基，加5mIPBS洗一遍，用移液管加1ml胰酶，洗一遍吸出，37度放1min左右計時(shí)看到大片大片脫落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。

293T細胞是用5型腺病毒75株系轉化，含有Ad5E1區的人胚腎亞三倍體細胞系，是一種E1區缺陷互補細胞系。293T 細胞是貼壁依賴(lài)型呈上皮樣細胞，表現出典型的腺病毒轉化細胞的表型細胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖

哺乳細胞的大規模培養方式有三種:貼壁培養、微載體培養、無(wú)血清懸浮培養這三種方式均可用于293T 細胞的大規模培養。293T細胞在無(wú)Ca2+或含Ca2+培養基中可同樣生

長(cháng)，也可生長(cháng)在血清濃度降低的培養基中。

單層培養細胞在 5-10%FBS-DMEM 中能生長(cháng)很好。一般來(lái)講，1:10 傳代后，一周可以長(cháng)滿(mǎn)嚴禁過(guò)度生長(cháng)，這點(diǎn)很重要。因為會(huì )導致細胞密度加大和堆積，影響病毒斑的形成和轉染，傳代時(shí)也不易打散

懸浮的293T細胞很容易大規模培養，但不容易長(cháng)期保持穩定。293T 細胞在傳代120次以后，其表型可能改變，生長(cháng)狀況不再是單層的了，偶爾會(huì )形成局部的細胞成團聚集，應立即拋棄，重新引入新傳代的細胞

293T細胞培養特性:

1. 細胞明顯適應酸性環(huán)境pH值在6.9~7.1時(shí)可順利貼壁生長(cháng)換液293T時(shí)動(dòng)作要輕。一般用高糖的DMEM培養基

2、傳代: 倒去廢液，PBS 洗一次 (輕)，用0.02%EDTA與0.25%Trypsin 消化，生長(cháng)良好細胞培養瓶中輕搖,使之流遍所有細胞表面,即將其吸除或棄去消化 30s，然后吸去，再讓剩下的EDTA/Trypsin 作用30s鏡下觀(guān)察細胞脫落,就可加DMEM 終止消化,反復吹打至細胞全成單個(gè)懸浮細胞即可。12小時(shí)-24小時(shí) 90%以上細胞貼壁。293細胞傳代時(shí)機為達 80-90%匯合，傳代比例為1:3。

3、293 細胞在低代時(shí)容易貼壁，生長(cháng)良好，在傳到幾十代以后，易聚集成團，且貼壁不牢，用PBS沖洗時(shí)即可能脫落，即使消化后也不容易吹打成單細胞懸液，最好購入時(shí)先大量?jì)龃?/span>

4、復蘇：293細胞的另一生長(cháng)特性是貼壁所需時(shí)間長(cháng)且貼壁不牢。細胞冷凍后復蘇時(shí),都有不同程度的腫脹若以50ml培養瓶待細胞長(cháng)滿(mǎn)瓶底的70%~80%時(shí)消化凍存,復蘇時(shí)將其全部接種至2個(gè)50ml 瓶中時(shí)較為合適。剛復蘇的 293 貼壁很慢，復蘇接種后24小時(shí)內,應盡量減少觀(guān)察細胞次數或不作觀(guān)察,以免因晃動(dòng)而影響細胞貼壁。復蘇后48 小時(shí)左右觀(guān)察貼壁情況并進(jìn)行更換培養基比較合適,如果用一次性塑料培養瓶可增加細胞貼壁牢度。換液前宜將培養基預熱

5轉染: 體外應用293細胞進(jìn)行細胞轉染時(shí)，如果是采用磷酸轉染，一定要注意 293 細胞不要全部長(cháng)滿(mǎn)細胞培養盤(pán)，長(cháng)滿(mǎn)細胞時(shí)加入磷酸鈣就會(huì )使 293 細胞大片的脫落，最好是當293生長(cháng)到 1/2或2/3 時(shí)進(jìn)行磷酸轉染，可以避免細胞的大量脫落

1.Corning® DMEM培養基

2. Corning® CellBIND® 6孔透明多孔板，平底，帶蓋，無(wú)菌  （產(chǎn)品編號3335  5/包 ）

3. Corning® CellBIND® 12孔透明多孔板，平底，帶蓋，無(wú)菌   （產(chǎn)品編號3336  5/包 ）

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5. Corning® Donor Horse Serum, 500 mL, United States Origin  （產(chǎn)品編號：35-030-CV ）