如何生產(chǎn)mRNA？

mRNA(信使核糖核酸)疫苗是一種能夠激發(fā)人體自身對特定抗原免疫反應的新型技術(shù)，它攜帶有mRNA的信息，其中包括特定病毒特征（即病毒抗原）的“藍本"或者代碼。這些信息使人體能夠自行合成病毒抗原：mRNA將生產(chǎn)抗原所需的信息輸送到人體制造蛋白的細胞機器中，然后，人體細胞將抗原呈遞到細胞表面，從而誘導所需的特定免疫反應。當人體接觸到對應的病毒時(shí)，免疫系統會(huì )識別出特定抗原，從而精準且迅速地攻擊病毒來(lái)阻止感染。

mRNA的生產(chǎn)過(guò)程——

1、DNA原液制備；

我們首先需要設計與構建含有S蛋白基因序列的載體，然后通過(guò)大腸桿菌放大培養，獲得大量的攜帶S蛋白基因序列的質(zhì)粒。

2、mRNA原液的制備；

獲取的攜帶S蛋白基因序列的質(zhì)粒線(xiàn)性化{（噬菌體啟動(dòng)子（T7）-5 UTR-開(kāi)放閱讀框（ORF）-3 個(gè)非翻譯區（UTR）-polyA}通過(guò)體外轉錄（IVT）將前mRNA5'端加帽子。后續需要經(jīng)過(guò)一系列的純化，除菌等過(guò)程。除去酶、游離核苷酸、殘留 DNA 和外源 RNA 片段，dsRNA, 及反應體系中的免疫原性雜質(zhì)。滿(mǎn)足 GMP 生產(chǎn)的質(zhì)量需求。

Moderna的mRNA還需要把尿苷替換成假尿苷，以降低免疫原性。

3、利用脂質(zhì)微粒進(jìn)行包封。

制備遞送系統，例如基于聚合物或脂質(zhì)的納米顆粒(LNP)，然后使用不同制造商不同的方法將純化的mRNA封裝在其中。由此產(chǎn)生的mRNA/遞送納米顆粒組件經(jīng)過(guò)濃縮、緩沖液交換和無(wú)菌過(guò)濾。然后最終評估并按此順序包裝成袋/瓶作為原料藥。原料藥通常在最終形成（盡管不適用于某些工藝）最終藥物產(chǎn)品填充之前冷凍儲存，在某些情況下隨后還需要進(jìn)行凍干。

在NGS及合成技術(shù)的快速發(fā)展的今天，病毒遺傳信息序列的解讀及序列合成已不是難題。如何將合成好的mRNA序列遞送進(jìn)入人體細胞變成了mRNA疫苗研發(fā)的重要挑戰之一。

人體細胞結構從外至內可分為細胞膜（cell membrane）、細胞質(zhì)（cytoplasm）、細胞核（nucleus）。mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程發(fā)生在細胞質(zhì)中，因此，mRNA疫苗要發(fā)揮作用，必須先將編輯好的mRNA遞送進(jìn)細胞質(zhì)中。

進(jìn)入細胞質(zhì)需要通過(guò)細胞膜，細胞膜由磷脂雙分子層構成，磷脂分子頭部具有親水性，尾部具有疏水性，兩層磷脂尾部相對形成雙分子層，能夠有效控制水分子、離子、大分子物質(zhì)通過(guò)。mRNA作為大分子（300-5000kDa），在不破壞細胞膜的前提下，進(jìn)出細胞只能以?xún)群w（endosome）通過(guò)胞吞作用（endocytosis）。

通常情況下，內含體進(jìn)入細胞質(zhì)后，會(huì )被直接送至溶酶體（lysosome）進(jìn)行分解。為保證mRNA在翻譯前保持完整性，mRNA需要在內含體與溶酶體結合前打破內含體包膜（endosomal disruption）并逃離。

逃離內含體進(jìn)入細胞質(zhì)后，mRNA便會(huì )在細胞質(zhì)內游動(dòng)，直至到達核糖體（ribosome）并在此轉譯為肽鏈，最終折疊成為蛋白質(zhì)。

對于mRNA疫苗和藥物，遞送系統有兩大職責：

1、有效包裹和保護mRNA在到達靶點(diǎn)前維持穩定，

2、幫助mRNA有效成分進(jìn)入細胞，

3、在mRNA到達溶酶體前將其釋放進(jìn)入細胞質(zhì)中。

LNP是目前有潛力的遞送載體之一。LNP（Lipid Nanoparticle）是脂質(zhì)微粒的總稱(chēng)，其中又包括脂質(zhì)膠團（micelle）、脂質(zhì)體（liposome）等。LNP與細胞膜的組成成分相似，均由脂質(zhì)分子構成。脂質(zhì)分子的兩條長(cháng)尾通常呈平行狀態(tài)，在此狀態(tài)下，脂質(zhì)形成的雙分子層穩定。

在進(jìn)入細胞質(zhì)酸性環(huán)境后，部分脂質(zhì)的頭部質(zhì)子化，呈現陽(yáng)離子形態(tài)，與其他陰性離子態(tài)的脂質(zhì)分子相吸引，尾部張開(kāi)。原本雙分子層的形式被破壞，形成頭部聚集在一起的環(huán)狀。之前包裹在內的mRNA便可逃逸出內含體，進(jìn)入細胞質(zhì)翻譯。

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