外泌體的這些哪些事？

常用外泌體研究樣本來(lái)源有哪些？

Chris Gardiner等2016發(fā)表的調查報告有報道細胞培養上清液是經(jīng)常使用來(lái)提取外泌體的樣本來(lái)源，除了細胞上清，其他最常見(jiàn)的體液是血漿(47%)、血清(22%)、尿液(14%)、腦脊液(8%)和乳汁(5%)

如何鑒定提取出來(lái)的外泌體？

以目前外泌體的分離手段很難獲得十分純凈而且單一的外泌體樣品，也沒(méi)有任何一個(gè)單一實(shí)驗可以確定外泌體的存在。根據國際細胞外囊泡協(xié)會(huì )發(fā)表的指導手冊《MISEV 2018》，外泌體特征鑒定通過(guò)NTA測粒徑分布、TEM電鏡分析形態(tài)、WB檢測標志蛋白三項來(lái)驗證。NTA分析樣品中外泌體的粒徑分布和顆粒濃度，TEM電子顯微鏡來(lái)觀(guān)察樣品中外泌體的形態(tài)特征，WB檢測外泌體標志蛋白。

外泌體如何保存？

不同時(shí)間、溫度的保存對不同的外泌體樣本影響不一；如果研究方向為外泌體形態(tài)特征、蛋白或其他功能性分析，在分離后新鮮使用為最佳。目前主流的建議是提取出外泌體后最好是新鮮使用，或低溫短期保存。短時(shí)間幾天內可以放4°C，長(cháng)時(shí)間儲存置于-80°C保存。

NTA檢測可以進(jìn)行外泌體定量嗎？

NTA是物理方法，基于顆粒的布朗運動(dòng)，因為不管是脂質(zhì)體、蛋白，甚至是PBS中的顆粒（部分實(shí)驗室自行配置的PBS中發(fā)現大量顆粒，推薦在外泌體研究中，用VC品牌的PBS（P/N:C3580-0500），避免干擾），都會(huì )被軟件讀取，并不能分辨是否為外泌體。但NTA提供的粒徑分布可供判斷所提取的內含物是否在外泌體的粒徑范圍內；另外，在做外泌體分泌的對比實(shí)驗中，NTA提供的濃度值也可以作為重要的參考數據。

外泌體NTA檢測需要多少量？

Zetaview儀器的最佳檢測區間是10^7 particles/ml，且有濃度檢測下限，為10^5 particles/ml，一般進(jìn)樣量不少于2 ml；無(wú)法準確建議送樣量，檢測需要量與樣本本身濃度有關(guān)，樣本濃，則用量小，反之則多，根據檢測經(jīng)驗，樣本取用量一般在2 µl-100 µl不等，取用量大于50 µl時(shí)大多由于樣本分泌量過(guò)低、提取失敗或者對樣本有過(guò)多稀釋。

一般建議：送樣量不低于30 µl。

WB檢測哪個(gè)蛋白指標？

外泌體相關(guān)文獻統計，排在前4位的檢測指標為CD63、TSG101、CD9、CD81；接著(zhù)檢測較多的4個(gè)指標為Alix、HSP70、flotillin和Syntenin等。然《MISEV 2018》并未提出可以特異性地表征外泌體的分子標記。僅列出了必須在所有外囊泡制劑中分析的三類(lèi)標記物，以證明外囊泡（類(lèi)別1和2）并評估其從常見(jiàn)污染物中的純度（類(lèi)別3）。
注：
類(lèi)別1：跨膜或GPI錨定蛋白，質(zhì)膜和/或胞內體上任何類(lèi)型外囊泡的標志，如CD63、CD81、CD82、CD9等；
類(lèi)別2：細胞溶質(zhì)蛋白（cytosolic proteins ，真核細胞和革蘭氏陽(yáng)性細菌）或周質(zhì)蛋白（periplasmicproteins，革蘭氏陰性細菌），分析確定脂質(zhì)雙分子層結構，如TSG101、HSP70、ALIX等；

類(lèi)別3：非外囊泡結構的主要成分，通常與外囊泡共同分離。主要用來(lái)評估外囊泡制劑的純度，如血清、血漿中的脂蛋白。

即《MISEV 2018》要求外泌體標志物鑒定，至少2個(gè)陽(yáng)性指標：CD9、CD63、CD81 三選一以及TSG101、HSP70、ALIX三選一，另外純度鑒定再加陰性對照。

WB檢測用什么內參基因？

目前大部分文獻中沒(méi)有檢測內參基因，個(gè)別文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作為內參進(jìn)行檢測，從文獻調研結果來(lái)看，外泌體中的Actin、GAPDH和Tubulin的表達豐度相對于正常細胞樣品中的較低，Western blot檢測時(shí)可能會(huì )檢測不到任何條帶或者條帶微弱。因此，更多的是用等蛋白定量校準樣品間的差異。

WB檢測需不需要裂解？

裂解和不裂解都可以，建議裂解，裂解后蛋白濃度會(huì )更高

外泌體電鏡是不是一定要有膜結構？

負染電鏡結果中外泌體的形態(tài)是那種明顯的茶托樣，邊緣有一圈略微更明亮的亮圈。如果結構是沒(méi)有膜結構的圓球形，很可能是脂蛋白顆?；蛘弑F的蛋白質(zhì)。

外泌體研究中細胞培養用無(wú)血清還是血清培養？

外泌體研究中，如果仍然使用胎牛血清培養細胞、通過(guò)收集上清液來(lái)提取外泌體，胎牛血清中大量的牛源外泌體將對實(shí)驗分析造成極大的干擾。建議使用去外泌體血清培養細胞。

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