原代細胞的培養及建系之原代細胞取材篇

細胞的來(lái)源多樣，培養方法也各不相同，凡是來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養的細胞稱(chēng)之為原代細胞。原代細胞經(jīng)分散接種之手段稱(chēng)為傳代。凡能經(jīng)傳代方式進(jìn)行再次培養的細胞稱(chēng)為傳代細胞。若能穩定生長(cháng)傳至10~20代以上的細胞可確立為細胞系。若有條件能開(kāi)展單細胞克隆、純化，經(jīng)大量擴增后所形成的生物學(xué)特性穩定的克隆化細胞群，稱(chēng)之為細胞株或克隆細胞。此過(guò)程稱(chēng)為細胞的純化或細胞克隆。這些基本技術(shù)是從事細胞培養工作的基礎，只有熟悉和掌握了基本技術(shù),才可能更快捷地學(xué)習和掌握其他方法,本章重點(diǎn)敘述常用的基本技術(shù)。   
第一節 原代細胞的取材   
人和動(dòng)物細胞的取材是原代細胞培養成功的首要條件，是進(jìn)行細胞培養的第一步，若取材不當，將會(huì )直接影響細胞的體外培養，現將取材的基本要求和注意事項敘述如下：   
一、取材的基本要求   
（1）取材要注意新鮮和保鮮 新鮮組織易于培養成功，取材時(shí)應盡量在4~6h內能制作成細胞，盡快入箱培養，若不能即時(shí)培養，應將組織浸泡于培養液內，于4℃存放。若組織塊較大，應在清除表面血液、壞死組織、脂肪和結締組織后，切碎于培養液內4℃存放，但時(shí)間不能超過(guò)24h。對于已切碎的組織或血液、淋巴組織應加入含10%二甲基亞砜的培養基，按細胞凍存方式于液氮中冷凍保存。   
（2）取材應嚴格無(wú)菌 所取標本材料應在無(wú)菌條件下進(jìn)行，為了確保無(wú)菌，對所取材料若疑有污染的可能，應將所取組織在含高濃度抗菌素（400單位/mL）甚至加入適量的兩性霉素B或10%達克寧液的培養液內于4℃下存放2小時(shí)以上，再用PBS洗2~3次，以確保所取材料無(wú)菌。要用無(wú)菌包裝的器皿或事先消毒好的帶少許培養液（內含400單位/mL抗菌素）的小瓶等便于攜帶的物品來(lái)取材，所取材料應避免接觸有毒有害的化學(xué)物質(zhì)，如碘、汞等。   
（3）取材和原代細胞制作時(shí)，要用鋒利的器械，如手術(shù)刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對細胞的機械損傷。   
（4）要仔細去除所取材料上的血液、脂肪、壞死組織及結締組織，切碎組織時(shí)應避免組織干燥，可在含少量培養液的器皿中進(jìn)行。   
（5）取材應注意組織類(lèi)型、分化程度、年齡等，一般來(lái)講，胚胎組織較成熟個(gè)體組織容易培養，分化低的較分化高的組織容易生長(cháng)，腫瘤組織較正常組織容易培養。取材時(shí)應盡量選用易培養的組織進(jìn)行培養。   
（6）原代細胞取材時(shí)要同時(shí)留好組織學(xué)標本和電鏡標本。對組織的來(lái)源、部位、包括供體的一般情況要做詳細的記錄，以備以后查詢(xún)。   
二、各類(lèi)組織的取材技術(shù)   
(一) 皮膚和粘膜的取材   
皮膚和粘膜是上皮細胞培養的重要組織來(lái)源，主要取自于手術(shù)過(guò)程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般2~4cm2即可，這樣局部沒(méi)有疤痕，若對燒傷皮膚進(jìn)行上皮細胞膜片移植，可從大腿或臀部取較大皮片，可取2~4cm2皮片，但取材時(shí)不要用碘酒消毒；若培養上皮細胞，取材時(shí)不要切取太厚，盡可能去除所攜帶的皮下或粘膜下組織；若欲培養成纖維細胞，則反之。皮膚粘膜與外界相通部位，因表面細菌、霉菌很多，取材時(shí)應嚴格消毒，必要時(shí)要用高濃度抗菌素和適量?jì)尚悦顾?/span>B漂洗、浸泡。   
(二)內臟和實(shí)體瘤的取材   
內臟除消化道外基本是無(wú)菌的，但取材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類(lèi)型和部位，實(shí)體瘤取材時(shí)要取腫瘤細胞豐富的區域，要避開(kāi)破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結締組織，否則培養后，由于成纖維細胞的生長(cháng)給以后的培養工作增加困難。對于一些特殊細胞培養的取材，詳見(jiàn)后面有關(guān)章節。   
(三)血液細胞的取材   
血液及淋巴組織中的血細胞、淋巴細胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中（如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結等）分離細胞，取材時(shí)應注意抗凝，通常采用肝素抗凝，常用肝素濃度為8~10u/mL血，抽血的針筒也要用肝素濕潤，若從血站取來(lái)的獻血員的血液，因血站不用肝素抗凝劑，常用含枸椽酸鹽抗凝，對此類(lèi)血標本千萬(wàn)不能用含鈣、鎂離子的洗液來(lái)處理細胞，因此時(shí)的鈣、鎂離子可加速血液中凝血酶促進(jìn)血液凝固而影響收獲血細胞及淋巴細胞。此外要嚴格無(wú)菌，盡量新鮮使用。   
(四)骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材   
取上述標本時(shí)，除嚴格無(wú)菌，注意抗凝外，還要盡快分離培養，一般無(wú)需其他處理，離心后，用無(wú)鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養液洗一次后即可培養，不宜低溫存放。具體操作詳見(jiàn)后面有關(guān)章節。   
(五)動(dòng)物組織取材   
1、鼠胚組織取材   
首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng)物，然后將其整個(gè)浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后（注意時(shí)間不能太長(cháng)，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內，影響組織活力），取出動(dòng)物，在消毒過(guò)的木板上可用無(wú)菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開(kāi)皮膚，用無(wú)菌操作法解剖取胚或用無(wú)菌止血鉗挾起皮膚、用無(wú)菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開(kāi)皮膚，用止血鉗分別挾住兩側皮膚拉向頭尾，把動(dòng)物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無(wú)菌解剖器材，采用無(wú)菌操作法解剖取出胚胎。   
2、幼鼠胚腎（或肺）取材   
幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開(kāi)游離毛皮并拉開(kāi)至兩側：然后采用無(wú)菌法打開(kāi)胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開(kāi)游離并拉向兩側，然后采用無(wú)菌法從背部打開(kāi)腹腔取腎。   
(六)人胚體組織取材   
在局部先用碘酒后用75%酒精棉球消毒，無(wú)菌法取人胚肺（腎），方法與鼠類(lèi)相同。   
(七)雞（鴨）鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材   
取孵化至適當胚齡（9~12天）的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動(dòng)的胚蛋，說(shuō)明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干，經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后，在無(wú)菌條件下采用無(wú)菌法用剪刀或中號鑷子打開(kāi)氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼，再用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚，再用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無(wú)菌平皿中，解剖取材。