原代細胞的培養及建系之原代細胞分離篇

 上篇寫(xiě)到原代細胞的取材，這篇文章說(shuō)一下原代細胞的分離制作：

 第二節 原代細胞的分離和制作   
     人或動(dòng)物體內（或胚胎組織）由于多種細胞結合緊密，不利于各個(gè)細胞在體外培養中生長(cháng)繁殖，即使采用1mm3的組織塊，也只有少量處于周邊的細胞可能生存和生長(cháng)，若需獲取大量細胞，必須將現有的組織塊充分散開(kāi)，使細胞解離出來(lái)，常采用的方法如下：   
一、懸浮細胞的分離方法   

組織材料若來(lái)自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，若懸液量大，可適當延長(cháng)離心時(shí)間，但速度不能太高，延時(shí)也不能太長(cháng)，以避免擠壓或機械損傷細胞，離心沉淀用無(wú)鈣、鎂PBS洗兩次，用培養基洗一次后，調整適當細胞濃度后再分瓶培養，若選用懸液中某些細胞，常采用離心后的細胞分層液，因為，經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據需要收獲目的細胞。不同比重的分層液的配制和具體分離方法詳見(jiàn)淋巴細胞分離培養的章節。   
二、實(shí)體組織材料的分離方法    
對于實(shí)體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。   
（一）機械分散法   
所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細胞或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內（用九號針），使細胞通過(guò)針頭壓出，或在不銹鋼紗網(wǎng)內用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細胞雖然簡(jiǎn)便、快速，但對組織機械損傷大，而且細胞分散效果差。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織。   
（二）消化分離法   
組織消化法是把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細胞間的橋連結構松動(dòng)，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個(gè)細胞的細胞懸液，接種培養后，細胞容易貼壁生長(cháng)。   
1、酶消化分離法   
        酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶，其分離方法如下：   
（1） 胰蛋白酶分散技術(shù)    
胰蛋白酶（簡(jiǎn)稱(chēng)胰酶）是廣泛應用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質(zhì)有水介作用，主要作用于賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細胞分散開(kāi)，在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同，對細胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對細胞的作用，取決于細胞類(lèi)型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無(wú)機鹽離子、pH以及消化時(shí)間的長(cháng)短等。   
①細胞類(lèi)型 胰蛋白酶適于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結締組織較豐富的組織,如 乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無(wú)效，但若與膠原酶合用,就能增加其對組織的分離作用。   
②酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都經(jīng)過(guò)測定而有效，但配制時(shí)必須新鮮，需保存在低溫冰箱中，消化時(shí)的pH和溫度都要適宜，否則會(huì )影響活力，細胞的分散直接與酶的活力有關(guān)，最終使用活力為1:200或1:250，56℃pH8.0時(shí)活力最好。   
該酶為粉劑，保藏時(shí)要防潮，室內溫度不宜過(guò)高，保存時(shí)間不能太長(cháng)，若粉劑結團塊,說(shuō)明該部分受潮或失效。   
③酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到難消化的組織時(shí)，濃度可適當提高，消化時(shí)間適當延長(cháng)。濃度高對細胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養液中可促進(jìn)細胞的增殖，若培養液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。   
④溫度 一般認為胰蛋白酶在56℃時(shí)活性最好，但由于對細胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為37℃，通常在37℃進(jìn)行消化比室溫作用快。   
⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強分散快，細胞也容易被消化下來(lái)，消化分離細胞時(shí)PH只能選用7.6～8.0之間，否則對細胞有損傷。   
⑥無(wú)機鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類(lèi)溶液來(lái)配制胰蛋白酶時(shí)，可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制時(shí)應采用無(wú)鈣鎂離子的PBS配制。   
⑦消化時(shí)間 如果細胞消化時(shí)間過(guò)長(cháng)，可以損害細胞的呼吸酶，從而影響細胞的代謝，一般消化時(shí)間為20分鐘為宜，冷消化時(shí)使用低濃度消化液，于4℃過(guò)夜也可。   
分離方法如下：   
①過(guò)夜冷消化 將取得的組織用Hanks液洗三次，剪成碎塊大小為4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪組織，再加入0.25%的胰蛋白酶，搖勻后放4℃過(guò)夜，次日再用Hanks液洗滌，棄去上清，共洗2~3次，然后，加入少量營(yíng)養液吹打分散，細胞計數，按適當的濃度分瓶培養。   
②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三種：   
熱消化多次提取——將剪碎的細胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分鐘，然后經(jīng)洗滌后用營(yíng)養液分散制成細胞懸液，按合適的濃度分瓶培養，然后將留下的未全部消化的組織按上述方法操作，再消化提取細胞。   
冷消化多次提取——方法同上，只是消化溫度為4℃。   
先熱消化后冷消化——將組織塊先用胰蛋白酶于37℃下消化20分鐘經(jīng)洗滌后用營(yíng)養液分散，制成懸液，剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4℃下過(guò)夜，次日再提取細胞，分散成懸液，分瓶培養。   
（2） 膠原酶（Collagenase）消化法    
    膠原酶是一種從細菌中提取出來(lái)的酶，對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用，對細胞本身影響不大，可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養液配制，即操作簡(jiǎn)便又可提高細胞成活率，最終濃度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用緩和，無(wú)需機械振蕩，但膠原酶價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗成本。   
    經(jīng)過(guò)膠原酶消化后的上皮組織，由于上皮細胞對酶有耐受性，可能有一些上皮細胞團塊尚未被全部消化開(kāi)。成小團塊的上皮細胞比分散的單個(gè)上皮細胞更易生長(cháng)，因此不必要再進(jìn)一步消化處理。   
    鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性（見(jiàn)表4-1）和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時(shí)間（小時(shí)）有差異（見(jiàn)表4-2），以及兩者價(jià)格不等，有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用，同時(shí)還可加透明質(zhì)酸酶（對細胞表面糖基有作用），采用兩者的聯(lián)合消化作用，對分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。   
表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別   
項 目                               胰蛋白酶                          膠原酶   
消化特性                         適用于消化軟組織              適用于消化纖維多的組織   
用 量                             0.01%～0.5%                  0.1～0.3mg/mL(200u/mL)   
消化時(shí)間                            0.5～2小時(shí)（小塊）               1～12小時(shí)   
pH                                    8～9                            6.5～7.0   
作用強度                               強烈                                緩和   
細胞影響                          時(shí)間過(guò)長(cháng)有影響                     無(wú)大影響   
血清、鈣、鎂離子                     有影響                           無(wú)影響   
表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時(shí)所需時(shí)間(小時(shí))(0.5～1cm3) 
酶 種 類(lèi)                           較 硬 組 織                       軟 組 織   
                                  4℃ 室 溫 37℃                   4℃ 室 溫 37℃   
胰蛋白酶(0.25%)                  24～48 1～6 1～2                 12～24 1～2 0.5～1   
膠原酶(200u/mL)                   24   6   6.5                     12   3   0.25   
兩者聯(lián)合(對沖)                  12～46 12～24 4～12                12～24 6～12 1～2   
除上述兩種經(jīng)常用的消化酶外，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年來(lái)，還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細胞更佳。   
2、非酶消化法（EDTA消化法）   
EDTA是一種非酶消化物，又稱(chēng)螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學(xué)物質(zhì)能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物，利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離，缺點(diǎn)是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團塊，常不單獨使用，但可與胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不僅利于細胞脫壁又利于細胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。   
消化分離法的操作步驟：   
（1）剪切 把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。   
（2） 加液漂洗 將碎組織塊在平皿（或三角燒瓶）中用無(wú)鈣鎂PBS洗2-3次（采用傾斜，自然沉降法）。   
（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或EDTA）于37℃水浴中作用適當時(shí)間（中間可輕搖1~2次），若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)。   
（4）棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。   
（5）漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應，采用漂洗法洗2-3次后，加入全部培養基。   
（6）機械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細胞充分散開(kāi)后用紗網(wǎng)或3~4層無(wú)菌紗布過(guò)濾后分瓶培養，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細胞懸液進(jìn)行分瓶培養。   
注意事項如下：   
（1）組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。   
（2）胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(cháng)，以避免毒性作用。   
（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕，以避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。    
三、原代細胞的培養方法   
原代細胞的培養也叫初代培養 是從供體取得組織細胞在體外進(jìn)行的第一次培養，是建立細胞系的第一步，是一項基本技術(shù)。原代細胞因剛從組織中分離開(kāi)，生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保留原來(lái)的遺傳特性，也很接近和反映體內生長(cháng)特性，適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等實(shí)驗研究。   
原代細胞往往有多種細胞組成，比較混雜，即使從形態(tài)上為同一類(lèi)型（上皮樣或成纖維樣），但細胞間仍有很大差異。如果供體不同，即使組織類(lèi)型、部位相同，個(gè)體差異也照樣存在，原代細胞生物特性尚不穩定，如需做較為嚴格的對比性實(shí)驗研究，還需進(jìn)行短期傳代培養。   
1、組織塊培養法   
組織塊培養是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養方法，也是早期采用培養細胞的方法，故原先被稱(chēng)為組織培養。其方法：為將剪成的小組織團塊接種于培養瓶（或皿）中，瓶壁可預先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著(zhù)于瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長(cháng)，方法簡(jiǎn)便，利于培養，部分種類(lèi)的組織細胞在小塊貼壁24小時(shí)后細胞就從組織塊四周游出，然后逐漸延伸，長(cháng)成肉眼可以觀(guān)察到的生長(cháng)暈，5~7天后組織塊中央的組織細胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮，此漂浮小塊可隨換液而棄去，由組織塊周?chē)由斓馁N壁細胞也逐漸形成層片，可在顯微鏡下觀(guān)察形態(tài)和用于實(shí)驗研究。  
其培養方法如下：   
(1)按照前述方法取材，將組織剪成或切成1mm3大小的小塊，并加入少許培養基使組織濕潤。   
(2)將小塊均勻涂布于瓶壁，每小塊間距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培養瓶(底面積為17.5cm2)可接種20～30小塊為宜,小塊放置后,輕輕翻轉培養瓶,使瓶底朝上,然后于瓶?jì)燃尤脒m量培養基蓋好瓶塞,將瓶?jì)A斜放置在37℃溫箱內。   

(3)培養2~4小時(shí)，待小塊貼附后，將培養瓶緩慢翻轉平放，靜置培養，動(dòng)作要輕，嚴禁搖動(dòng)和來(lái)回振蕩，以防由于沖動(dòng)而使小塊漂起而造成培養失敗，若組織塊不易貼壁可預先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開(kāi)始培養時(shí)培養基不宜多，以保持組織塊濕潤即可，培養24小時(shí)后再補液，培養初期移動(dòng)和觀(guān)察時(shí)要輕拿輕放，開(kāi)始幾天盡量不去搬動(dòng)，以利貼壁和生長(cháng)，培養3~5天時(shí)可換液，一方面補充營(yíng)養，一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。   
原代細胞培養－2   
2.消化培養法   
該方法是采用前述的消化分散法，將妨礙細胞生長(cháng)的細胞間質(zhì)（包括基質(zhì)、纖維等）去除，使細胞分散形成細胞懸液，然后分瓶培養。   
某些特殊類(lèi)型細胞，如內皮細胞、骨細胞等的消化手段和步驟，將在有關(guān)章節中敘述。   
3.懸浮細胞培養法   
對于懸浮生長(cháng)的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無(wú)需消化，可采用低速離心分離，直接培養，或經(jīng)淋巴細胞分層液分離后接種培養。   
4.器官培養   
器官培養是指從供體取得器官或組織塊后，不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養，其特性仍保持原有器官細胞的組織結構和聯(lián)系、并能存活，器官培養的目的和技術(shù)均與單層細胞培養不同，但可利用器官培養對器官組織的生長(cháng)變化進(jìn)行體外觀(guān)察。并觀(guān)察不同培養條件研究對器官組織的影響。器官培養可保持器官組織的相對完整性，可用于重點(diǎn)觀(guān)察細胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調節作用。體外器官培養為臨床上的organ transplant創(chuàng )造了便利的條件。器官培養的條件與細胞培養不同，要有特殊的要求。   
1. 器官培養的特殊的要求   
(1)需要特殊的培養條件 因器官離體培養，其營(yíng)養和氧氣僅靠自然滲透來(lái)供給，因此，培養時(shí)為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營(yíng)養而造成壞死，其厚度或直徑不宜超過(guò)1mm。   

(2)器官內部細胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法：   
a. 將器官組織塊置于培養基氣液面以利于氣體交換。   
b. 提高培養基中的氧分壓，一般需加注純氧，提高氧分壓時(shí)仍需保持5% CO2，以維持pH。   
2. 器官培養的方法   
(1)將不銹鋼網(wǎng)做成的支架，放置于培養皿中，高度為1/2皿高，使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。   
(2)將培養基加入平皿中，使培養液剛剛接觸到濾膜，但不要使濾膜浮起。   
(3)將要培養的器官組織平放在濾膜上，一般厚度不要超過(guò)200μm，水平面積不超過(guò)10mm2，如為肝、腎不能大于1mm2。   
(4)將培養物置于CO2培養箱內，并加注氧氣，調整氧分壓達90%，培養時(shí)注意使液面與膜保持在一致的水平上。   
(5)上述器官培養1~3周（每隔2~3天換液一次）后可用于實(shí)驗和檢測。