原代細胞的培養及建系之原代細胞的培養篇

前面寫(xiě)了原代細胞的取代、分離，今天講述一下原代細胞的培養：

第三節 原代和傳代細胞的培養和維持   
一、原代細胞的培養與維持   
(一)原代細胞培養   
1、靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養)   
凡經(jīng)消化液處理實(shí)體組織來(lái)源的細胞要通過(guò)充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性，細胞接種時(shí)濃度要稍大一些，至少為5×108細胞/L，培養基可用Eagle(MEM)或DNEM培養，小牛血清濃度為10%～80%，有條件的應在37℃ 5% CO2的培養箱中培養，在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細胞發(fā)生脫落，漂浮。若原代貼壁細胞不是用于長(cháng)期培養，只是用于分離繁殖或測定病毒之用，其細胞濃度可以加大，盡量貼成厚層以利病毒的效價(jià)提高和測定結果（如空斑）更加明顯、準確，待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀，此時(shí)的pH若有明顯變化，應將原代細胞換液，即倒去舊液，換入新鮮的培養基，以便除去衰老、死亡的細胞和陳舊的培養基，使貼壁細胞能獲得充足的營(yíng)養。   
若用骨髓或外周血中的懸浮細胞經(jīng)靜置培養1周時(shí)，可有少量的肌樣纖維間質(zhì)細胞或基質(zhì)細胞開(kāi)始貼壁生長(cháng)，為了利于該貼壁細胞充分貼壁和生長(cháng)，此時(shí)換液應將細胞懸液經(jīng)低速離心后，按半量換液方式棄去舊液加入新液，然后再將細胞懸液放入原瓶中繼續培養，經(jīng)反復幾次換液后，貼壁肌樣細胞逐漸形成網(wǎng)狀，此時(shí)換液可將原懸浮細胞和培養基移入另一新瓶，然后分別補加新鮮培養基(也按半量換液方式分別對半加入新液)繼續培養，原瓶的貼壁細胞逐漸長(cháng)成單層，而新瓶中又會(huì )出現二次貼壁細胞，經(jīng)幾次換液也會(huì )逐漸長(cháng)成單層，在此類(lèi)細胞培養時(shí)，培養基中往往需加入少量的維生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清（濃度要在20%以上），以利細胞貼壁生長(cháng)。   
2、懸浮細胞的培養   
凡來(lái)自外周血、胸腹水、脾臟、淋巴結、骨髓的淋巴細胞、造血干細胞以及白血病細胞，在原代培養時(shí)要盡量去除紅細胞。若作用于試驗的短期培養，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養基中進(jìn)行培養，細胞濃度可在5～8×109/L范圍內，然后進(jìn)行分瓶試驗。若要將淋巴細胞及白血病細胞進(jìn)行長(cháng)期培養，淋巴細胞中要加入生長(cháng)因子，白血病細胞中要加入少量的原患者血清，以利細胞生長(cháng)，待細胞開(kāi)始增殖甚至結成小團塊，培養基中pH變酸，說(shuō)明細胞生長(cháng)繁殖良好，一般每隔3天需半量換液一次（換液時(shí)盡量使細胞不丟失），待細胞增殖加快，濃度明顯增加，pH發(fā)生明顯變化時(shí)，此時(shí)可考慮傳代。但千萬(wàn)不能急于傳代，一定要待細胞密度較高時(shí)才能進(jìn)行，以防傳代失敗。  

(二)原代細胞的維持   
1、貼壁細胞（包括半貼壁細胞的換液）   
貼壁細胞長(cháng)成網(wǎng)狀或基本單層時(shí)，由于營(yíng)養缺乏，代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，不適宜細胞生長(cháng)，此時(shí)細胞還未長(cháng)成單層，未達到飽和密度，仍需繼續培養，因此，需采取換液方式來(lái)更新?tīng)I養成分以滿(mǎn)足細胞繼續生長(cháng)繁殖的需要。其換液方法比較簡(jiǎn)單，即棄去舊液，加入與原培養液相同的等量全部培養基。若希望細胞能在較長(cháng)時(shí)間內能維持存活，但不需增殖，此時(shí)要換成含2%小牛血清的維持液。   
2、懸浮細胞   
凡經(jīng)培養后只在細胞培養基中懸浮生長(cháng)而不貼壁的細胞，需在倒置顯微鏡下方可觀(guān)察到細胞的形態(tài)和生長(cháng)現象，淋巴細胞的短期培養無(wú)需換液，但加入生長(cháng)因子或有絲分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，細胞不僅會(huì )發(fā)生轉化而且會(huì )發(fā)生分裂繁殖，此時(shí)培養基中的營(yíng)養成分并不能維持細胞的營(yíng)養需求，加之代謝產(chǎn)物增多，pH變酸，細胞不適宜生長(cháng)，需進(jìn)行換液。白血病細胞或淋巴瘤細胞體外長(cháng)期培養時(shí)，都需換液培養，待達到飽和密度時(shí)才能傳代。換液時(shí)，只能采用半量換液的方式，千萬(wàn)不能采取倒去舊液加入新液的方式進(jìn)行換液。 
半量換液的方法如下：   
將原培養瓶豎起，在30分鐘內，若細胞沉于瓶底，可用吸管輕輕吸去一半上清棄去，再加入等量的新鮮全部培養基。若細胞不能沉于瓶底，可吸出細胞懸液，采用低速離心（1000r/min 10min）棄去一半上清加入等量的新鮮全部培養基，混勻后再轉入原瓶繼續培養。   
二、原代細胞培養的第一次傳代   
原代培養后由于懸浮細胞增殖，數量增加甚至達飽和密度，貼壁細胞的相互匯合，使整個(gè)瓶底逐漸被細胞覆蓋，細胞難以繼續生長(cháng)繁殖，需要進(jìn)行分瓶培養，這種使原代細胞經(jīng)分散接種的過(guò)程稱(chēng)之為傳代。每進(jìn)行一次分離再培養稱(chēng)之為傳一代，傳至5～10代以?xún)鹊募毎ǔ７Q(chēng)為次代培養細胞，傳至10~20代以上的細胞，通常確定為傳代細胞（或稱(chēng)傳代細胞系）。然而，傳代細胞系的建立，關(guān)鍵是初代培養的第一次傳代。 
應注意如下幾點(diǎn)：   
(1)細胞生長(cháng)密度不高時(shí)，或未能達到覆蓋整個(gè)瓶底時(shí)不能急于傳代。   
(2)原代培養的貼壁細胞多為混雜細胞，形態(tài)各異，往往是上皮樣細胞和成纖維樣細胞并存，采用胰蛋白酶消化時(shí)要掌握好消化時(shí)間，因成纖維細胞易于脫壁，上皮細胞不易脫壁，因此，可根據需要選用適當的消化時(shí)間及時(shí)中止消化。在早先傳代時(shí)，其消化時(shí)間比一般已建系的細胞相對長(cháng)一些。   
(3)吹打已消化的細胞要輕巧，既不能聽(tīng)到有明顯的吹打聲，又不能有大量泡沫在懸液中形成，以盡可能減少對細胞的機械損傷。   
(4)第一次傳代時(shí)細胞接種數量要多一些，以利于細胞的生存和繁殖。如果消化分離的細胞懸液有組織塊，也一并傳入到培養瓶，盡量減少細胞損失。   
(5)第一次傳代培養時(shí)的pH不能高，寧可偏低一些。此外，小牛血清濃度可適當加大至15%～20%左右。   
三、傳代細胞的傳代培養   
原代細胞經(jīng)傳代后所形成的傳代細胞，可根據不同細胞采取不同的方法進(jìn)行細胞傳代。貼壁生長(cháng)的細胞用消化法傳代，部分貼壁的細胞用直接吹打或用硅膠軟刮的刮除法傳代。懸浮細胞可采用加入等量新鮮培養基后直接吹打分散進(jìn)行傳代，或用自然沉降法加入新培養基后再吹打分散進(jìn)行傳代。后兩種傳代方法比較簡(jiǎn)單，唯有貼壁細胞的消化傳代法比較復雜一些。 
現將具體方法介紹如下：   
(1)吸除或倒掉原瓶中的舊培養基（以25mL培養瓶為例）。   
(2)每瓶加入2mL，無(wú)鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。   
(3)每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02鞹A或混合液），輕輕搖動(dòng)培養瓶，經(jīng)消化液鋪滿(mǎn)所有細胞表面，待細胞層略有松動(dòng)，肉眼可觀(guān)察到“薄膜"現象時(shí)，倒掉消化液，再繼續作用2～3分鐘，輕輕搖動(dòng)，細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來(lái)，在顯微鏡下可發(fā)現細胞回縮變圓，細胞間隙增大，此時(shí)應立即終止消化。   
(4)加入全部培養基5mL，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，吹打時(shí)要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過(guò)大，盡可能不要出現泡沫，以避免細胞的機械損傷。   
(5)用計數板計數，計算細胞的濃度，并用培養基調整適當的細胞濃度后再分瓶培養。   
四、傳代細胞的建系和維持   
細胞系的維持是培養工作的重要內容，是通過(guò)換液傳代再換液、再傳代和細胞種子凍存來(lái)實(shí)現的，但對每一個(gè)細胞系來(lái)說(shuō)都有其自身的特點(diǎn)，要做好建系的維持須注意以下幾點(diǎn)：   
1.細胞檔案   
細胞檔案要記錄好，如組織來(lái)源、生物學(xué)特性（由形態(tài)、生長(cháng)繁殖曲線(xiàn)、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無(wú)支原體和潛存病毒等）、培養基的要求、傳代換液時(shí)間、擴增時(shí)間(分裂指數)，細胞的特殊遺傳標志(標記染色體)等，這些記錄對于保證細胞的正常生長(cháng)，保持細胞的一致和經(jīng)長(cháng)期培養細胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。   
2.換液傳代   
(1)細胞系的傳代、換液方法與前相同，但一般都有自身的規律性，因而在繼續傳代時(shí)，要注意保持其穩定的規律性，這樣可以減少由于傳代時(shí)細胞密度的頻繁增減或換液時(shí)間的不規律而導致細胞生長(cháng)特性的改變，給以后的實(shí)驗帶來(lái)影響。   
(2)多種細胞系維持傳代，要嚴格操作程序，對所用的試劑各系不能交叉，甚至每個(gè)細胞系均需單獨實(shí)驗室，傳代時(shí)各系均分開(kāi)單獨操作，每傳5代后，細胞種子均應凍存。傳代時(shí)均應作好記錄，培養瓶上要有明顯標記，標記細胞系名稱(chēng)和傳代的代數及傳代時(shí)間。若細胞生長(cháng)較快，可減去換液程序，每次均可傳代。每個(gè)傳代細胞系，最好能分成2～3條線(xiàn)，分別傳代，同時(shí)也可在適溫或4℃短期存放一瓶，以防止污染丟失。細胞種子的及時(shí)凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細胞變異，此外還可提供不同代次的細胞同時(shí)進(jìn)行對比試驗。   
3.細胞系（或株）的鑒定和管理   
當一個(gè)細胞系（或株）建立后，專(zhuān)家鑒定可有可無(wú)，按國際慣例，只要認真研究，記錄完整，資料和結果確切，就可在有關(guān)雜志上或刊物上報道細胞的各次實(shí)驗指標。   
下面為美國標準細胞庫或細胞銀行（ATCC）入庫細胞的基本要求：   
（1）培養簡(jiǎn)歷 組織來(lái)源日期、物種、組織來(lái)源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)，細胞已傳代數等。   
（2）凍存液 培養基和保護劑名稱(chēng)。   
（3）細胞活力 凍融前后細胞接種存活率和生長(cháng)特性(生長(cháng)繁殖曲線(xiàn)，分裂指數等)。   
（4）培養液 培養基種類(lèi)和名稱(chēng)、血清來(lái)源及濃度。   
（5）細胞形態(tài) 類(lèi)型，如上皮或成纖維細胞等。   
（6）核型 二倍體或多倍體，標記染色體有或無(wú)。   
（7）無(wú)污染情況 包括細胞、真菌、支原體、原蟲(chóng)和病毒等。   
（8）物種檢測 檢測同功酶，主要為G6PD和LDH，以證明細胞有無(wú)交叉污染。   
（9）免疫檢測 一兩種血清學(xué)檢測。   
（10）細胞建立者 建立者姓名、檢測者姓名。    
第四節 細胞的純化和克隆   
體外培養的細胞源于人或動(dòng)物體內或胚胎組織，其體內的細胞都是混雜生長(cháng)，每一種組織都有血管和間葉組織，因此，來(lái)源于上述組織的培養材料的原代細胞、傳代細胞絕大多數都呈混合生長(cháng)，即有上皮樣細胞，又有纖維樣細胞，纖維樣細胞又包括成纖維細胞、肌細胞、骨細胞、滑膜細胞等，混雜的細胞會(huì )直接影響實(shí)驗結果，而利用體外培養細胞進(jìn)行實(shí)驗研究時(shí)，為了保證實(shí)驗結果的可靠性、一致性、穩定性和可重復性，要求采用單一種類(lèi)細胞來(lái)進(jìn)行實(shí)驗，這樣才能對某一細胞的功能、形態(tài)等變化進(jìn)行一系列研究，因而培養細胞的純化就成為實(shí)驗研究的重要一步，甚至需要從混雜的細胞群中分離出單個(gè)細胞來(lái)進(jìn)行培養和開(kāi)展實(shí)驗研究。   
一、細胞的純化   
細胞的純化一般分為兩種，即自然純化和人工純化?？筛鶕煌毎N類(lèi)、來(lái)源、實(shí)驗要求和目的選擇采用。   
(一)自然純化   
自然純化即利用某一種類(lèi)細胞的增殖優(yōu)勢，在長(cháng)期傳代過(guò)程中靠自然淘汰法，不斷排擠其他生長(cháng)慢的細胞，靠自然增殖的潛力，最后留下生長(cháng)優(yōu)勢旺的細胞，達到細胞純化的目的。但這種方法常無(wú)法按照需要和實(shí)驗要求及目的來(lái)選擇細胞，此法花費時(shí)間長(cháng)，留下來(lái)的往往是成纖維細胞。僅有那些惡性變的腫瘤細胞或突變的細胞可以通過(guò)此方法而保留下來(lái)，不斷純化而建立細胞系。   
(二)人工純化   
人工純化，即利用人為手段造成某一細胞生長(cháng)有利的環(huán)境條件，抑制其他細胞的生長(cháng)從而達到純化細胞的目的。   

1、細胞因子依賴(lài)純化法   
人和動(dòng)物組織中某些細胞需要有特殊的細胞因子存在的微環(huán)境才能長(cháng)期存活和生長(cháng)繁殖，如IL-2是T細胞生長(cháng)所必需的細胞因子，BCGF是B細胞的生長(cháng)因子，體外培養中淋巴細胞若加入IL-2就可使T細胞生長(cháng)繁殖，形成IL-2依賴(lài)的T細胞系，如CTLL-2細胞株，而其他細胞則自然被淘汰，采用此法還建立了IL-6依賴(lài)的細胞系，如B9、CTD7細胞株。   
2、酶消化法   
酶消化法是比較常用的純化方法，不僅對貼壁細胞可行，能利用上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同，使兩者分開(kāi)，達到純化的目的，對貼壁細胞與半貼壁及粘附細胞間的分離純化也是十分有效的。   
（1）上皮細胞與成纖維細胞的分離純化   
兩者在胰蛋白酶的作用下，由于成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長(cháng)的時(shí)間才脫壁，特別是在原代細胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯，故可采用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開(kāi)。 
方法如下：   
①采用常規消化傳代方式 將0.25%胰蛋白酶注入培養瓶?jì)葍纱?，每次?/span>1mL（25mL培養瓶）來(lái)回輕搖1-2次，使胰蛋白酶流過(guò)所有細胞表面，然后倒掉。   
②蓋好瓶塞（或蓋），將培養瓶放在倒置顯微鏡下觀(guān)察，發(fā)現纖維樣細胞變圓，部分脫落，立即加入2mL有血清的培養液終止消化。   
③用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細胞生長(cháng)的區域（可事先在鏡下用記號筆在培養瓶上劃出記號）。吹打時(shí)不要用力，也不要吹打上皮細胞生長(cháng)區域。吹打結束后，再用少量培養液漂洗一遍，然后加入適量培養液于瓶?jì)壤^續培養，也可重復上述操作再進(jìn)行一次，隔幾日后或下次傳代時(shí)，再進(jìn)行上述操作，經(jīng)過(guò)幾次處理，就可將成纖維細胞去除或將兩者分開(kāi)。   
（2）骨髓基質(zhì)肌樣細胞的純化   
在血液細胞和骨髓細胞靜置培養時(shí)，常有許多肌樣細胞和骨髓基質(zhì)細胞貼壁生長(cháng)，但也有許多淋巴細胞、單核細胞、粒細胞粘附其上，種類(lèi)混雜，鑒于粘附細胞貼壁不牢固，也可用酶消化法使粘附細胞脫壁分離，以達到骨髓基質(zhì)細胞或血液中肌樣細胞與淋巴細胞分開(kāi)和純化的目的。 
其方法如下：   
①待基質(zhì)或肌樣細胞基本形成單層時(shí)，倒去舊液，加入無(wú)鈣、鎂PBS漂洗，并用力搖動(dòng)后倒掉，反復洗2~3次后，一方面可洗去血清和鈣鎂離子以助酶消化，另一方面又可使大部分粘附細胞被洗掉，但仍留有不少粘附細胞。   
②將0.25%胰蛋白酶注入培養瓶?jì)?，每?/span>1mL（25mL培養瓶），輕輕搖動(dòng)讓胰蛋白酶流過(guò)細胞表面，作用1~2分鐘后再輕輕搖動(dòng)1~2次后倒去。   
③蓋好瓶蓋，在普通顯微鏡下觀(guān)察，發(fā)現基質(zhì)或肌樣細胞由于貼壁較牢固未脫壁，而原先粘附的細胞已浮起，此時(shí)再加2mL PBS洗一次倒掉，盡量除去粘附細胞。   
④加入含血清的培養基終止消化，再繼續用力搖動(dòng)后倒掉，加入培養基繼續培養。隔幾日或下次傳代前，再進(jìn)行上述操作，經(jīng)過(guò)幾次處理和傳代培養后就可將粘附細胞去除，將兩者分開(kāi)，達到使骨髓基質(zhì)細胞或肌樣細胞純化的目的。   
3、機械刮除法   
原代培養時(shí),如果上皮細胞和成纖維細胞為分區成片混雜生長(cháng)，每種細胞都以小片或區域性分布的方式生長(cháng)在瓶壁上?？刹捎脵C械的方法去除不需要的細胞區域而保留需要的細胞區域。

其方法如下：   

(1)將要純化細胞的培養瓶，在凈化室內放在倒置顯微鏡監視下進(jìn)行。   
(2)用硅橡皮刮子在不需要生長(cháng)的細胞區域推劃，使細胞懸浮在培養液中，注意不要傷及所需細胞。   
(3)推劃后用培養液沖洗振搖兩次倒掉，即可將培養基加入原瓶繼續培養。   
(4)數日后如發(fā)現不需要的細胞又長(cháng)出，可再進(jìn)行上述操作，這樣反復多次可以純化細胞。操作過(guò)程中要嚴格無(wú)菌操作，防止污染。   
4、反復貼壁法   
成纖維細胞與上皮細胞相比，其貼壁過(guò)程快，大部分細胞能在短時(shí)間內（大約10~30min）完成附著(zhù)過(guò)程（但不一定全部伸展），而上皮細胞（大部分）在短時(shí)間內不能附著(zhù)或附著(zhù)不穩定，稍加振蕩即浮起，利用此差別可以純化細胞。 
其方法如下：   
(1)將細胞懸液接種在一個(gè)培養瓶?jì)龋ㄗ詈门囵B液內不含血清，此時(shí)上皮細胞貼壁更慢）靜置20分鐘。   
(2)在倒置顯微鏡下觀(guān)察，見(jiàn)部分細胞貼壁，稍加搖動(dòng)也不浮起時(shí)，將細胞懸液倒入另一培養瓶中，繼續靜置培養20min，然后再重復上述操作后，即可將上皮細胞和成纖維細胞分隔開(kāi)，在第1瓶和第2瓶以成纖維細胞為主，往后幾瓶即以上皮細胞為主，下次傳代時(shí)再按上述方法處理，就可使兩者達到全部分開(kāi)的目的。   
5、電烙篩選法   
在貼壁細胞轉化時(shí)，往往在培養瓶的細胞層中會(huì )出現分散的轉化灶，轉化灶區域細胞密集、排列規則，有明顯生長(cháng)趨勢，與周邊未能轉化的細胞有明顯的區域界限，此時(shí)即可用機械刮除法去除未轉化細胞，也可用電烙篩選法燙死未轉化細胞而保留轉化灶細胞。 
其方法如下：   
(1)倒去舊液，并用記號筆劃出轉化灶的區域。   
(2)用加熱的微型電烙器(類(lèi)似焊接用的電烙鐵)將轉化灶周邊的細胞全部燙死，只保留轉化灶細胞。在單細胞克隆篩選時(shí)，也可用此法將單個(gè)細胞周?chē)募毎麣⑺?，然后在適應性培養基中（50%是舊液）繼續培養，即可達到純化的目的。   
二、細胞的克隆化   
        細胞克隆技術(shù)又稱(chēng)單個(gè)細胞分離培養技術(shù)，即從細胞群體中分離出一個(gè)細胞，并使其在體外培養體系中能繁殖成新的細胞群體，這種由單個(gè)細胞所形成的細胞群（或集落）稱(chēng)為一個(gè)克隆，這種純化后的細胞群體稱(chēng)為細胞株。它們當中每個(gè)細胞的遺傳特征和生物學(xué)特性極為相似和一致，有利于對不同群體細胞的形態(tài)和功能進(jìn)行比較和研究。若該細胞株只是一般傳代、無(wú)一系列實(shí)驗鑒定指標，則為一般細胞株。若有一系列實(shí)驗指標報道的，則稱(chēng)為限定性細胞株，如由幼地鼠腎細胞系（BHK21）第13孔的單個(gè)細胞形成的細胞株稱(chēng)BHK-21C-13（代表克隆13），其形態(tài)規則，特性穩定，便于研究。   

        單一細胞體外培養能否生長(cháng)繁殖最后形成克隆，這與各細胞克隆形成率有關(guān)，如果細胞克隆形成率偏低（小于10%）應采用一些措施，如改用胎牛血清，適應性培養基添加刺激因子（如胰島素、地塞米松、細胞生長(cháng)因子等），調節CO2濃度以控制pH。若貼壁效果差可選用適當的適應性底物（如膠原層或血漿纖維蛋白層），以及制備底層的飼養細胞。用X線(xiàn)或60Co照射處理的細胞層，如雞胚細胞、骨髓基質(zhì)細胞，該細胞照光后只有代謝功能，無(wú)增殖和傳代能力，或選用短壽的細胞，常選用鼠腹水巨噬細胞作飼養細胞，用于單克隆抗體雜交瘤細胞的克隆化。
具體克隆方法如下：   
1.毛細管法：   
將一定量的細胞懸液（如105/mL或更低）稀釋至1個(gè)細胞/mL，取10mL稀釋的細胞懸液，用直徑為0.5mm，長(cháng)為8mm的毛細玻璃管若干（30～50只），在負壓作用下，使懸液吸入各毛細管中，在倒鏡下檢查出每管只進(jìn)入一個(gè)細胞的毛細管，然后放入適應性培養基或有飼養層細胞的培養瓶（或培養板）內，在CO2培養箱中培養，由一個(gè)細胞在毛細管繁殖后，并向管外擴展，并形成單個(gè)克隆的細胞群體。   
2.有限稀釋法   
有限稀釋法采用梯變倍數稀釋的原則，將稀釋的細胞懸液接種于微孔培養板中（也可在板上的96孔中直接稀釋?zhuān)┡囵B一定時(shí)間后，孔中可出現單個(gè)細胞克隆，本法不需特殊設備，操作簡(jiǎn)單快速，適合大批量克隆化培養?，F已廣泛用于異質(zhì)性細胞系的克隆化培養、誘導和分離耐藥性或高轉移性、或突變細胞株以及單克隆抗體雜交瘤細胞株的克隆篩選中。 
具體方法如下：  
（1）取對數生長(cháng)期的細胞制成懸液(貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，經(jīng)臺盼藍染色計數，測定活細胞數及濃度（細胞存活率及單個(gè)細胞百分率應高于90%以上）。   
（2）將細胞懸液在試管中稀釋?zhuān)门囵B基將細胞稀釋至50個(gè)細胞/mL、10個(gè)細胞/mL、5個(gè)細胞/mL，將3種稀釋度的細胞分別接種于96孔板中，每孔為0.1mL，于37℃ 5%CO2下培養。   
（3）次日在倒置顯微鏡下觀(guān)察培養板各孔中的細胞數，挑選只含一個(gè)細胞的孔，做好標記并補加0.1mL培養液繼續培養。   
（4）培養期間，視pH值的變化決定是否換液或補加培養液，一周左右，孔中有明顯克隆出現，待長(cháng)至孔底面的1/3～1/2時(shí)，可用消化法將96孔中的單一克隆的細胞分別移至24孔板中進(jìn)行擴大培養。  

3.平皿克隆分離法   
        在平皿內將單個(gè)細胞形成克隆并進(jìn)行分離培養的方法如下：   
(1)將對數生長(cháng)期細胞制備單個(gè)細胞懸液（懸浮細胞用吸管吹打分散，貼壁細胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培養基吹打分散）計數并用培養基調整細胞濃度，使5mL培養液內含有50～200個(gè)細胞（細胞存活率及單個(gè)細胞百分率應大于90%以上）。   
(2)將上述細胞懸液迅速移入60mm平皿中，在37℃ 5% CO2下培養1周或更長(cháng)。若有明顯的克隆形成時(shí)方可進(jìn)行克隆分離，方法有兩種：   
①套環(huán)法：在倒置顯微鏡下觀(guān)察克隆形成的情況， 標記單個(gè)克隆周邊，吸干培養基，用涂有少量無(wú)菌硅脂的無(wú)菌金屬套環(huán)，套住標記的克隆，在套環(huán)內滴加少量0.25%胰蛋白酶，待細胞脫離時(shí)，用注射器針頭輕輕吹打分散后，轉入小平皿或24孔板或6孔板中擴大培養。   
②玻片法：在接種細胞懸液前，預先在60mm平皿中放入無(wú)菌小玻片，加入細胞懸液，培養一定時(shí)間后，在倒置顯微鏡下標記上含一個(gè)克隆的玻片，然后用無(wú)菌鑷子取出標記玻片轉入24孔培養板中繼續培養。   
4.軟瓊脂克隆分離法   
本法僅適用于懸浮培養的類(lèi)淋巴細胞或惡性程度高的貼壁細胞，而正常貼壁細胞在軟瓊脂中不能形成克隆。   
（1）將對數生長(cháng)期的細胞制成單個(gè)細胞懸液(貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶消化使之分散成單個(gè)細胞)作活細胞計數。調整細胞濃度至1×106細胞/L，然后根據實(shí)驗要求再作梯倍稀釋。通常以1~5×104個(gè)細胞/L為佳。   
（2）制備底層瓊脂 取5%瓊脂置沸水中，使瓊脂全部溶化，取出一份5%瓊脂，移入小燒杯中，待冷至50℃，迅速加入9份預溫37℃的新鮮培養液（即成為0.5%瓊脂），混勻后立即注入24孔培養板中，每孔含0.5% 瓊脂0.8mL，置室溫使瓊脂凝固備用（此層也可以省略）。   
（3）制備上層瓊脂 取37℃保溫的、不同濃度的細胞懸液9.4mL，移入小燒杯中，加入50℃ 5% 瓊脂0.6mL迅速混勻，即配成0.3%瓊脂培養基，立即澆入鋪有底層瓊脂的24孔培養板中，每孔0.8ml，置室溫使瓊脂凝固。   
（4）于37℃ 5% CO2下培養1~2周或更長(cháng)，若需培養更長(cháng)時(shí)間可補加0.8mL/孔含瓊脂的培養液，待有明顯集落形成為止。   
（5）集落（克?。┯嫈担涸诘怪蔑@微鏡下觀(guān)察并計數直徑大于75μm或含有50個(gè)細胞以上的克隆。  

5．單細胞顯微操作法   
借助顯微操縱器，在顯微鏡監控下將單個(gè)細胞逐個(gè)吸出，移入含有飼養層細胞的培養板中進(jìn)行培養。本法準確性好，如無(wú)顯微操縱器可自制毛細吸管替代。

方法如下：   
（1）飼養層細胞的制備 單個(gè)細胞在極低密度下生長(cháng)非常緩慢，甚至難以分裂，為了促進(jìn)克隆細胞的生長(cháng)繁殖，常采用飼養層細胞，飼養細胞種類(lèi)和制備方法依實(shí)驗要求而定，現以3T3小鼠纖維細胞為例：   
①用0.25%胰蛋白酶消化單層貼壁生長(cháng)的3T3細胞，調整細胞濃度為108細胞/L，在96孔板中每孔加入0.1mL細胞懸液于37℃ 5% CO2中培養至單層。   
②將已形成單層的3T3細胞板，用60Co γ線(xiàn)以4000～6000拉得輻射或在培養液中加入mitomycin（終濃度為10-6mol/L）作用16h。其目的是使細胞有絲分裂能力喪失，但仍可短期存活，有代謝功能，不僅可維持pH而且還可為克隆細胞提供必要的養分及刺激生長(cháng)的因子。飼養細胞處理后需更換新鮮培養液。   
(2)制備單個(gè)細胞懸液 方法同上。   
(3)分離單個(gè)細胞 其方法多樣，可根據實(shí)驗條件決定：   
①毛細管吸入法 同上述毛細管法，在顯微鏡下將只有一個(gè)細胞的毛細管取出。   
②微滴法 將經(jīng)稀釋至103個(gè)細胞/L的單個(gè)細胞懸液，用無(wú)菌的1mL注射器逐滴加在平皿中制成散滴，在顯微鏡下挑選出單個(gè)細胞的液滴，再用毛細管取出單個(gè)細胞懸滴。   
③液體石蠟法 將經(jīng)稀釋至103個(gè)細胞/L的單個(gè)細胞懸液，用無(wú)菌的1mL注射器逐滴加入充滿(mǎn)無(wú)菌液體石蠟的平皿底部，在倒置顯微鏡下挑選只有一個(gè)細胞液滴，仔細用毛細吸管取出有一個(gè)細胞的液滴。   
④玻璃小球附著(zhù)法 將稀釋至103個(gè)細胞/L的細胞懸液加入表面涂有無(wú)菌凡士林石蠟的小玻璃珠的平皿中，混勻后，在倒置顯微鏡下挑選玻璃珠表面只粘附一個(gè)細胞的玻珠，仔細用鑷子取出。   
(4)將采用上述方法分離出的單個(gè)細胞，放入預先制備飼養層細胞的96孔培養板中，于37℃ 5% CO2下培養1~2周或更長(cháng)。   
(5)待細胞克隆明顯，并使孔底覆蓋1/3～1/2時(shí)，即可將細胞轉種于24孔板進(jìn)行擴大培養（貼壁細胞仍需用0.25%胰酶消化法取出轉種）。