Invivogen抗污染抗生素常見(jiàn)問(wèn)題

?抗污染抗生素

細胞培養過(guò)程中如何避免細胞污染？

1 進(jìn)行細胞培養時(shí)確保處于無(wú)菌環(huán)境，并使用恰當的滅菌技術(shù)。

2 細胞培養過(guò)程中所使用的培養基或添加的培養物均要確保無(wú)菌無(wú)污染。

3 定期使用顯微鏡或檢測試劑盒監測細胞培養基，以確保無(wú)微生物污染。

4 使用抗污染抗生素。在原代細胞培養或克隆過(guò)程中微生物污染是難以發(fā)現的，Invivogen公司為此設計了具有預防功能的防污染試劑。Invivogen公司可提供的抗污染抗生素有Plasmocin™ prophylactic，Normocin™， Primocin™ 及Fungin™。

如何鑒別細胞培養過(guò)程中被哪種微生物污染？

如果細胞培養過(guò)程中存在細菌和/或真菌污染，可以使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行鑒別。因為它們的生長(cháng)速度很快，可以使細胞培養基出現渾濁或菌斑，一般48小時(shí)后即可用肉眼檢測。隨后可使用檢測試劑盒對這些微生物種類(lèi)進(jìn)行鑒定。然而，支原體污染不能直接用肉眼觀(guān)察，也不能通過(guò)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行鑒別，只能通過(guò)不一樣的分析方法（如支原體檢測試劑盒）進(jìn)行檢測。因此，在細胞培養過(guò)程中支原體污染很容易被忽視。Invivogen提供的PlasmoTest™支原體污染檢測試劑盒結果可靠，分析準確，尤其是可以排除假陽(yáng)性或不確定的結果。

針對不同微生物的污染，應如何選擇Invivogen的抗污染抗生素？

在凍存細胞之前的細胞培養過(guò)程中，可以添加抗污染抗生素嗎？

可以的，在凍存細胞之前可以添加Plasmocin™ prophylactic（預防支原體污染試劑）或廣譜抗生素Normocin™。但是，在這之前需使用光學(xué)顯微鏡鑒定細胞是否被細菌或真菌污染，或使用PlasmoTest™支原體檢測試劑盒檢測是否存在支原體污染。

Invivogen是否可以提供一種可以同時(shí)抵抗細菌、真菌、支原體污染的抗生素嗎？

Normocin™和Primocin™這兩款抗生素是廣譜性的，可同時(shí)抵御細菌、真菌、支原體的污染。兩者的區別是Primocin™推薦用于原代細胞培養中預防微生物的污染，而Normocin™則推薦用于細胞系培養。

在細胞培養過(guò)程中可以同時(shí)使用Invivogen的抗污染抗生素及基因篩選抗生素嗎？抗污染抗生素會(huì )影響基因篩選抗生素的作用效果嗎？

在細胞培養過(guò)程中可同時(shí)使用Invivogen的抗污染抗生素及基因篩選抗生素，抗污染抗生素的使用不會(huì )干擾常用的基因篩選抗生素的作用效果，例如G418, Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B和 Zeocin™。

?細菌污染

細胞培養過(guò)程中應如何鑒別細菌污染？

由于細菌比真核細胞小很多，因此在細菌污染的早期階段通常被認為是細胞碎片。這個(gè)時(shí)候應使用放大倍數為100×-400×的光學(xué)顯微鏡觀(guān)察細胞培養基的狀態(tài)。如果觀(guān)察到黑色斑點(diǎn)、桿狀物或螺旋狀物，那培養基應該是被細菌污染了。由于細菌生長(cháng)快速，在污染后的48小時(shí)內便可引起培養基的變化，使培養基變渾濁。若培養基中含有酚紅，由于細菌的新陳代謝使培養基的pH下降，從而導致培養基的顏色迅速變?yōu)辄S色。因此在細菌污染48小時(shí)之后，便可用肉眼直接觀(guān)察。微生物污染后的細胞培養基應該棄去，但如果沒(méi)有其他替代的培養基可用，則可使用Invivogen的Plasmocin™ Treatment, Normocure™或者 Plasmocure™污染物清除試劑。

當在細胞培養過(guò)程中不確定具體是哪種細菌污染細胞時(shí)，應該選擇哪種抗污染抗生素？

當不確定細胞是被哪種細菌污染時(shí)，推薦使用對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有效，具有光譜抗性的Normocure™。目前的研究結果表明，Normocure™可有效預防細胞培養過(guò)程中的細菌污染，例如葡萄球菌、無(wú)色桿菌。

?真菌污染

細胞培養過(guò)程中應如何鑒別真菌污染？

由于真菌菌絲可用肉眼或光學(xué)顯微鏡觀(guān)察，因此真菌污染細胞培養基之后可直接通過(guò)肉眼或者光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測。酵母（30-10 um）是形態(tài)結構最小的真菌，在光學(xué)顯微鏡下便可被觀(guān)察到。另外，真菌的生長(cháng)繁殖會(huì )導致培養基中pH值增加，從而使含酚紅的培養基呈粉色。在大量真菌污染物存在的情況下，菌落可能形成霉菌，漂浮在培養基表面。此時(shí)應立即丟棄培養基，以防孢子傳播。

細胞培養過(guò)程中為預防或清除真菌污染，Fungin™可以與青霉素、鏈霉素（Pen-Strep）同時(shí)使用嗎？

可以的，Fungin™可以與一般的抗生素如青霉素、鏈霉素一起使用。

Fungin™可以在麥康凱瓊脂培養基（MacConkey Agar）和血平板培養基中使用嗎？ 

可以的，Fungin™可以在其他培養基，如麥康凱瓊脂培養基（MacConkey Agar）和血平板培養基中使用。

已經(jīng)使用Fungin™處理了7天，但不確定真菌污染是否已全部被清除，對于這個(gè)問(wèn)題有什么建議嗎？

Invivogen建議將培養基分成兩份，一份繼續使用Fungin™繼續處理3-4天，另外一份中加入無(wú)Fungin™或青霉素-鏈霉素的新鮮培養基，之后取1 mL至沙氏葡萄糖瓊脂培養基中，將培養皿置于20-25℃ 3-5天。此方法可以幫您確認培養基中的真菌污染物是否已全部被清除。

推薦使用什么濃度的Fungin™處理細胞？

說(shuō)明書(shū)中推薦使用50 ug/mL的Fungin™處理細胞，但Invivogen建議同時(shí)做75 ug/mL的平行處理組，以估計去除真菌污染的最佳使用劑量。處理時(shí)間應持續5-10天。

?支原體污染

如何使用Invivogen的支原體檢測試劑盒Plasmo TestTM檢測支原體？

PlasmoTest™支原體檢測試劑盒是一種基于細胞的比色分析方法，利用Toll樣受體II可以識別支原體成分（脂肽）的能力，誘導信號級聯(lián)反應，導致NF-κB和其他轉錄因子的激活。在支原體存在的情況下，HEK-Blue™-2細胞表面表達的TLR2會(huì )激活這些轉錄因子，進(jìn)而誘導分泌sAP（分泌性堿性磷酸酶）報告蛋白，可在16 - 24小時(shí)內被HEK-Blue™檢測培養基檢測到。

Invivogen的支原體檢測試劑盒Plasmo TestTM只能檢測活的支原體嗎？

PlasmoTest™支原體檢測試劑盒是通過(guò)檢測支原體脂蛋白來(lái)判斷是否有支原體存在的，因此其既可以檢測細胞培養基中存在的活的支原體，也可以檢測死的支原體。

另外，Invivogen的PlasmoTest™支原體檢測試劑盒不僅可以檢測支原體的脂蛋白，也可以檢測細菌的脂蛋白。但是由于細菌污染可直接通過(guò)觀(guān)察細胞培養基的狀態(tài)進(jìn)行鑒定，因此，當PlasmoTest™檢測試劑盒結果呈現陽(yáng)性，且細胞培養基無(wú)渾濁、顏色無(wú)變化時(shí)，可以斷定培養基受到了支原體污染。

Invivogen的支原體檢測試劑盒Plasmo TestTM與其他支原體檢測試劑盒相比，有什么優(yōu)勢嗎？

PlasmoTestTM是第一個(gè)基于細胞分析原理檢測細胞培養基中支原體污染的試劑盒，操作者只需具有基本的細胞培養的知識即可進(jìn)行操作。試劑盒在過(guò)夜孵育之后，一小時(shí)之內即可獲得檢測結果。以往常用的支原體檢測方法是PCR，但這種檢測方法具有明顯的缺陷，例如假陰性結果且能夠檢測的支原體種類(lèi)受引物限制，無(wú)法對全部支原體進(jìn)行檢測。最重要的是，Plasmo TestTM檢測結果呈陽(yáng)性時(shí)，即表明細胞培養基中存在支原體污染物，因此不會(huì )出現假陽(yáng)性結果。

在細胞培養過(guò)程中使用哪種試劑來(lái)預防支原體污染？使用那種試劑清除已污染的支原體？

● Plasmocin™ prophylactic（支原體預防試劑）是專(zhuān)門(mén)用于預防支原體污染的，它含有兩種有效的殺菌成分，作用于蛋白質(zhì)合成和DNA復制。

● Plasmocin™ treatment（支原體清除試劑），可在2 - 3周內快速有效地消除支原體污染。如果2-3周之后使用Plasmocin™支原體清除試劑之后無(wú)法有效清除支原體污染，或支原體對Plasmocin™產(chǎn)生了耐藥性，可使用● Plasmocure™。Plasmocin™ treatment和Plasmocure™均是由兩種不同抗生素混合而成，通過(guò)不同的機制發(fā)揮作用，可使支原體在2 - 3周內全部清除。

在細胞培養時(shí)，可以直接使用Plasmocure™代替Plasmocin™ treatment清除已污染的支原體嗎？

Plasmocin™ treatment和 Plasmocure™均是混合抗生素，用于清除已污染支原體。然而，Invivogen推薦只有在支原體對Plasmocin™ treatment產(chǎn)生抗性的情況下才可使用Plasmocure™。

如果支原體對Plasmocure™、Plasmocin™ treatment均已產(chǎn)生抗性，應該怎么辦呢？

如果使用Plasmocure™、Plasmocin™ treatment均無(wú)法有效清除細胞中的支原體污染物，則表明樣本中的支原體污染非常嚴重。這種情況下好的辦法是在下一次傳代時(shí)盡可能稀釋您的細胞，以此來(lái)稀釋細胞中的支原體污染物。之后使用不同濃度（確保對細胞不會(huì )有太大毒性的濃度）的Plasmocure™再次處理細胞2周，例如使用工作濃度為50 ug/mL和100 ug/mL的Plasmocure™處理細胞。處理2周之后，將細胞分成兩份，一份使用Plasmocure™繼續處理一周，另一份不添加任何抗生素，3天后使用PlasmoTest™支原體檢測試劑盒檢測污染情況，以避免出現假陰性結果。如果您的細胞仍存在支原體污染，請重復以上步驟。

以上的操作步驟可有效清除90%的支原體污染，若您樣本中的支原體污染物未得到有效清除，請及時(shí)聯(lián)系我們。