蛋白糖基化修飾及其分析方法簡(jiǎn)介

1.糖基化定義

糖基化是在酶的控制下，蛋白質(zhì)或脂質(zhì)附加上糖類(lèi)的過(guò)程，發(fā)生于內質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等部位。在糖基轉移酶作用下將糖轉移至蛋白質(zhì)，和蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基共價(jià)結合。蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)糖基化作用，形成糖蛋白。糖基化是對蛋白的重要的修飾作用，有調節蛋白質(zhì)功能作用。糖基化的結果使不同的蛋白質(zhì)打上不同的標記，改變多肽的構象和增加蛋白質(zhì)的穩定性。

蛋白糖基化
2.糖基化修飾的作用及類(lèi)型

作為一種普遍存在的翻譯后修飾，蛋白質(zhì)糖基化影響蛋白的功能，在許多生物過(guò)程中起著(zhù)重要的作用，如免疫保護、病毒的復制、細胞生長(cháng)、細胞與細胞之間的黏附、炎癥的產(chǎn)生等。很多蛋白，如轉錄因子、熱休克蛋白、核小孔蛋白、RNA聚合酶Ⅱ、致癌基因翻譯產(chǎn)物、酶等，都發(fā)現了糖基化這種翻譯后修飾方式。

糖基化的作用可概括為3點(diǎn)：①使蛋白質(zhì)能夠抵抗消化酶的作用；②賦予蛋白質(zhì)傳導信號的功能；③某些蛋白只有在糖基化之后才能正確折疊。糖基一般連接在4種氨基酸上，分為兩種：N-連接的糖基化（N-linked glycosylation）：與天冬酰胺殘基的NH?連接，連接的糖為N-乙酰葡糖胺；O-連接的糖基化（O-linked glycosylation）：與Ser、Thr和Hyp的OH連接，連接的糖為半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，在高爾基體上進(jìn)行O-連接的糖基化。

N-連接和O-連接的糖基化
3.蛋白質(zhì)的糖基化分析

蛋白質(zhì)的糖基化分析主要包括以下幾個(gè)方面：糖基化是否發(fā)生；在哪里發(fā)生了糖基化；糖基化的類(lèi)型是什么；糖鏈中各種糖的種類(lèi)和含量；糖鏈的一級結構等。應用于糖鏈結構解析方面的質(zhì)譜技術(shù)和核磁共振技術(shù)，各種技術(shù)有其各自?xún)?yōu)缺點(diǎn)，在應用中可以互補。目前糖分析的研究技術(shù)主要分為兩大部分：分離富集親和技術(shù)、糖蛋白鑒定/糖基化位點(diǎn)確定方法。其中分離富集親和技術(shù)包括：①凝集素親和技術(shù)；②肼化學(xué)富集法；③親水色譜法；④β- 消除米氏加成反應，糖蛋白鑒定 / 糖基化位點(diǎn)的確定方法包括：① PNGase F酶法；②Endo H酶法；③三氟甲基磺酸(trifluoromethananesulphonic acid，TFMS)法。以下著(zhù)重介紹一下分析糖鏈結構的質(zhì)譜法和核磁共振法。

（1） 質(zhì)譜法

經(jīng)典質(zhì)譜分析技術(shù)通常采用酶法或者化學(xué)的方法把糖鏈與肽鏈分開(kāi)，再分別在氨基酸序列水平或者糖鏈水平進(jìn)行進(jìn)一步的分析。有研究采用膜上樣品直接質(zhì)譜分析技術(shù)，這種技術(shù)需要的樣品量小，因此1個(gè)2-D膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)可以被分為若干份進(jìn)行處理，一部分用蛋白酶進(jìn)行酶解，用于蛋白質(zhì)的鑒定，另一部分用糖苷酶進(jìn)行酶解，用于寡糖鏈結構的研究，再將這兩部分結合起來(lái)，就可以得到糖肽的信息。

(2) 核磁共振法(NMR)

目前，NMR技術(shù)已成為糖鏈立體化學(xué)結構分析的方法之一，可確定糖鏈的構型、連接位置、分支和微觀(guān)多樣性。Kogelberg等從人乳中分離出一種未果糖型和3種不同果糖型的寡糖。通過(guò)ES-MS和NMR的結合使用確定其結構特點(diǎn)，通過(guò)ES-MS/MS分析闡明其分支類(lèi)型、 血型相關(guān)劉易斯決定簇、部分序列和寡糖鏈連接情況，然后通過(guò)甲基化分析和1H-NMR確定其全序列。再鑒定出三種新的糖鏈結構:未果糖結構，單果糖結構和三果糖結構。但NMR測定糖的訊號峰重疊嚴重，解析較難，靈敏度不高，而且多維NMR需要毫克級樣品，這對多數糖復合物中的微量糖鏈是很難達到的。

4.小結

蛋白質(zhì)糖基化是溝通蛋白質(zhì)和糖這二大類(lèi)生物大分子的橋梁。在蛋白質(zhì)組學(xué)水平進(jìn)行蛋白質(zhì)糖基化研究有助于認識蛋白質(zhì)糖基化發(fā)生、發(fā)展的規律及其在整個(gè)生命過(guò)程中的生物學(xué)意義，有助于從基因組-蛋白組-糖組這樣一個(gè)宏觀(guān)的綜合的層面上觀(guān)察分析生命現象，達到對生命現象更本質(zhì)的認識，進(jìn)而有助于發(fā)病機制的闡明，為疾病的早期診斷、治療等提供指導。