細胞鑒定指南

細胞污染是細胞生物學(xué)實(shí)驗室中常見(jiàn)的情形。細胞污染通常分為微生物污染和真核生物污染。微生物污染指的是真菌、細菌、支原體等的污染。微生物污染容易辨識，可通過(guò)肉眼和利用顯微鏡觀(guān)察培養基的顏色變化進(jìn)行判斷。細菌污染通常使培養基變黃，且顯微鏡下有小黑點(diǎn)，酵母污染的培養基變紫色，顯微鏡下可見(jiàn)透明成串的圓形斑。但支原體污染較難看出，因為支原體的生長(cháng)較慢，因此很容易被忽略。真核生物污染是由于實(shí)驗員操作不當發(fā)生的細胞系之間的交叉污染。為避免細胞污染造成深遠的影響，細胞鑒定萬(wàn)不可少。

細胞系的鑒定主要圍繞四個(gè)方面進(jìn)行：

1、種系來(lái)源：常用技術(shù)包括STR分型，限制片段長(cháng)度多態(tài)性（AFLP），染色體組分析，同工酶分析，人淋巴細胞抗原（HLA）分型。STR分型是重要的種系來(lái)源判斷手段。STR位點(diǎn)，又被稱(chēng)為微衛星，是3-7 bp的短串聯(lián)重復序列，具有高度多態(tài)性，被稱(chēng)為細胞的DNA圖譜指紋，因此可以進(jìn)行STR分型，通過(guò)與專(zhuān)業(yè)數據庫比對，判斷樣本所屬細胞系。

2、組織來(lái)源：常用技術(shù)包括形態(tài)學(xué)手段、免疫組化分析。形態(tài)學(xué)手段是利用不同組織可能具有特殊的形態(tài)學(xué)結構判斷組織來(lái)源。免疫組化是利用標記的抗體定位組織特異性抗原來(lái)確定細胞的組織來(lái)源。

3、特異性功能檢測：根據細胞種類(lèi)和功能，采用特異性指標鑒定細胞。比如，腺細胞產(chǎn)生分泌蛋白或者激素。腫瘤細胞需要具備腫瘤組織的特性。

4、是否發(fā)生轉化和惡變：常用技術(shù)包括核型分析、細胞生長(cháng)行為觀(guān)察（是否接觸抑制）、裸鼠成瘤實(shí)驗等。核型分析包括對染色體數目、形態(tài)、組成的研究，常用到染色體染色技術(shù)。核型分析可揭示染色體是否發(fā)生畸變、細胞功能、進(jìn)化活動(dòng)和分裂關(guān)系。長(cháng)期傳代可能會(huì )造成染色體畸變，因此需要定期檢查染色體核型。正常細胞在培養過(guò)程中可能會(huì )轉化，獲得永生性或者惡型性。因此需要鑒定來(lái)區分正常細胞或者腫瘤細胞。

腫瘤細胞鑒定

對于腫瘤細胞，需要鑒定其是否保留腫瘤組織的特性，因此需要進(jìn)行一些鑒定步驟，包括集落形成實(shí)驗、成瘤性檢測和正常組織侵襲實(shí)驗等。

a. 細胞集落形成實(shí)驗：癌細胞株對培養條件的適應性較強、獨立生存能力也較強，細胞集落率更高。因此可以通過(guò)測定細胞集落形成率，判斷細胞的生長(cháng)能力，從而判定是否為無(wú)限細胞系。

b. 成瘤性檢測：將腫瘤細胞注射進(jìn)入裸鼠體內，檢測是否能在裸鼠體內形成腫瘤。

c. 正常組織侵襲實(shí)驗：該實(shí)驗是檢測腫瘤細胞是否對正常組織具有侵襲和轉移的能力。

d. 其他：其他還包括對于密度依賴(lài)生長(cháng)特性改變（接觸抑制）、分子水平特征的鑒定。接觸抑制是判定腫瘤和正常細胞的重要依據。

干細胞鑒定

干細胞的重點(diǎn)是檢測細胞的多能性。常規鑒定方法包括核型分析、擬胚體（EB）形成分析、三胚層分化檢測、堿性磷酸酶染色、多能性標志物檢測和畸胎瘤檢測等。

a. EB分化檢測：EBs是人誘導多能干細胞的三維聚集物，即是干細胞多能性的標志。EB分化檢測的流程是：將EB接種于含血清的培養基中自發(fā)分化，然后利用流式檢測三胚層表面標志物，判定多能性。

b. 三胚層分化檢測：分別將胚胎干細胞或者誘導多能干細胞向三胚層分化培養，分別檢測特定胚層的標志物，從而判斷其多能性。

c. 堿性磷酸酶（Ap）染色：未分化的干細胞會(huì )高水平表達Ap。通過(guò)對固定的干細胞染色，分化的細胞無(wú)色，未分化的細胞呈現紫色或者紅色。Ap染色是一種低成本、簡(jiǎn)單快速的方法。

d. 多能性標志物檢測：未分化狀態(tài)的ES和iPS能表達特定的表面標志物，包括TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA-3、SSEA-4、Nanog、SOX2、Oct4等。

e. 畸胎瘤檢測：將一定數量的干細胞注射進(jìn)入免疫缺陷小鼠體內， 4-12周后，多能干細胞能生成畸胎瘤?；チ霭巳齻€(gè)胚層的組織，可通過(guò)組織學(xué)手段檢測。但是該方法耗時(shí)費力，費用大。