免疫組化IHC常見(jiàn)問(wèn)題

發(fā)布時(shí)間： 2024-03-14　　點(diǎn)擊次數： 188次

IHC信號微弱/無(wú)信號
問(wèn)題	解決方案
抗體效力	a. 抗體效價(jià)不高?？赏ㄟ^(guò)增加抗體使用濃度，延長(cháng)抗體孵育時(shí)間進(jìn)行調整。 b. 所用抗體不適用于IHC實(shí)驗。建議在非變性WB上測試該抗體，以確?？贵w識別非變性抗原，或是選用通過(guò)IHC實(shí)驗驗證的抗體。 c. 一抗二抗不匹配。使用針對一抗物種來(lái)源的二抗，如一抗宿主為rabbit，則須使用anti-rabbit的二抗。 d. 抗體失活。避免將標記熒光基團的二抗放置于光照環(huán)境。
酶底物失活或呈色時(shí)波長(cháng)設置錯誤	a. 顯色溶液失去作用，可能是由于底物緩沖液中含有酶抑制劑，或底物緩沖液的pH值不適當。建議取一滴二抗標記酶與底物溶液反應, 可確認顯色溶液是否失去活性。 b. 錯誤的激發(fā)波長(cháng)。呈色前確保激發(fā)波長(cháng)與使用的熒光基團相匹配。
樣品制備問(wèn)題	a. 脫蠟作用不足。建議延長(cháng)脫蠟時(shí)間，使用新鮮配制的二甲苯。 b. 固定液（福爾馬林或 PFA) 可能改變表位。建議利用抗原修復方式使表位暴露出來(lái)或縮短固定作用的時(shí)間。 c. 固定作用不適當。避免延遲固定或過(guò)度固定，一般建議至少固定6小時(shí)以上，18~24小時(shí)已可滿(mǎn)足大多數實(shí)驗應用。 d. 冰凍切片樣品保存期過(guò)長(cháng)。冰凍切片制備完成后，最好于1-2個(gè)月內用完，超過(guò)6個(gè)月的話(huà)，建議制備新的玻片。 e. 熒光染色樣品保存不當。熒光基團在光線(xiàn)下暴露時(shí)間過(guò)長(cháng)，可能會(huì )導致信號減弱，建議在避光環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗和保存樣品，也可使用防熒光淬滅的封片劑封固樣本。
樣品屬性	a. 靶蛋白含量低。建議設置為陽(yáng)性対照組，增加抗體使用量或利用放大步驟來(lái)放大信號。 b. 靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細胞核。建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入滲透試劑，以促進(jìn)抗體滲透到細胞內。 c. 靶蛋白為膜蛋白而表位可能因為滲透作用被破壞或移除。建議將緩沖液中的滲透試劑減少或移除。 d. 較厚的組織。如斑馬魚(yú)全胚胎或染色建議做細胞破膜，以便抗體順利進(jìn)入胞內與相應抗原結合。關(guān)鍵步驟：在每次的實(shí)驗中，設置陽(yáng)性與陰性對照組，以確認是該次實(shí)驗的抗體、試劑、組織切片、實(shí)驗過(guò)程的問(wèn)題，還是靶蛋白自身表達量低的問(wèn)題。
IHC非特異性染色/背景值比較高
問(wèn)題	解決方案
固定方式或組織自身可能存在自發(fā)熒光	a. 嘗試用非醛類(lèi)替代醛類(lèi)。 b. 用淬滅自發(fā)熒光的染料或方法處理組織樣品：如短波長(cháng)的UV照射、蘇丹黑等。 c. 將石蠟包埋樣品的方法換成冰凍切片（OCT或明膠），減少固定液的影響。 d. 選擇不會(huì )與自發(fā)熒光競爭的熒光染料。福爾馬林、PFA或戊二醛等會(huì )產(chǎn)生高背景的熒光，尤其在使用綠色、藍色和紅色波長(cháng)光譜范圍時(shí)；組織中的紅細胞或膠原蛋白等組分會(huì )產(chǎn)生很強的自發(fā)熒光，尤其是使用綠色和紅色通道的熒光檢測時(shí)。 f. 使用福爾馬林或PFA固定過(guò)久。一般建議至少固定6小時(shí)以上，18~24小時(shí)已可滿(mǎn)足大多數實(shí)驗應用，注意：如固定時(shí)間到了無(wú)法繼續后續脫水、包埋程序，一定要將組織置換到PBS保存，切勿一直泡于固定液中，否則有可能造成蛋白交聯(lián)無(wú)法修復。 g. 配置新鮮的固定液
封閉、洗脫或顯色問(wèn)題	a. 增加封閉液濃度、延長(cháng)封閉時(shí)間。 b. 更換封閉液成分，注意: 封閉液成分不可與一抗物種同來(lái)源，最好與二抗物種同源，如二抗來(lái)自馬血清，使用馬血清可得到較干凈的背景。 c. 底物過(guò)量：縮短底物孵育時(shí)間。 d. 信號過(guò)度放大：縮短信號放大試劑孵育時(shí)間。 e. 洗脫液不適合：如果原本是用PBS，可更換使用TBS
抗體濃度太高或非特異性結合	a. 降低抗體濃度，如1：100調整為1：1000。 b. 縮短抗體孵育時(shí)間，并在4°c 孵育。 c. 增加封閉緩沖液濃度。 d. 做多個(gè)目標蛋白染色時(shí)，建議使用預吸附二抗減少與其他物種一抗的交互作用。 e. 針對二抗與組織發(fā)生非特異性結合的情況建議每次實(shí)驗都要設置一組不加一抗，只加二抗的對照組，才能確認信號是來(lái)自高背景值還是真實(shí)信號。
內源性酶（過(guò)氧化氫酶或堿性磷酸酶）	a. 使用酶抑制劑。 - 過(guò)氧化物酶：使用H2O2 (0.3% v/v) - 堿性磷酸酶：使用 Levamisol (2 mM)
內源性生物素	與 Avidin 孵育以封閉生物素
組織問(wèn)題	a. 脫蠟不，可能導致細胞核染色在呈相時(shí)模糊，亦可能導致抗體無(wú)法辨認抗原或者高背景值。 b. 抗原修復方式不適合，建議更換修復溶液成分或方法。 c. 一抗與組織物種同源。較常發(fā)生在使用鼠源抗體染鼠源組織時(shí)，除了避開(kāi)同樣物種來(lái)源的一抗和組織之外，也可以使用 Mouse-on-Mouse IHC染色試劑盒 (GTX83396) 迸行實(shí)驗。 d. 任何時(shí)候都不要讓組織干掉。
IHC實(shí)驗結果形態(tài)不佳
問(wèn)題	解決方案
組織切片從載玻片上脫落	a. 使用新鮮配制、適當帶電或疏水處理過(guò)的載玻片。 b. 石蠟切片貼于載玻片后，于60°C烘烤3-5小時(shí)最為合適，烘烤不足容易掉片。 c. 實(shí)驗過(guò)程中要輕柔沖洗載玻片上的組織。
組織切片撕裂、褶皺或有氣泡	a. 切片刀鈍或是刀刃上有缺口。建議使用鋒利刀片重新制備切片。 b. 刀刃上有蠟屑的積留，請隨時(shí)將廢屑殘渣用毛刷清除干凈。 c. 刀沒(méi)夾緊或刀的角度傾斜。適當調節切片刀的角度，并確認刀片和蠟塊都有夾緊。 d. 移動(dòng)刀座，如果劃痕還是出現在相同位置，應該是組織標本內有污物或硬物的問(wèn)題。 e. 確認組織無(wú)過(guò)度脫水，并調節適當切片速度。 f. 在分析實(shí)驗結果時(shí)，避免損壞切片區域。 g. 避免展片時(shí)于載玻片上形成的氣泡。
組織形態(tài)分辨率差	a. 制備較薄的切片。一般來(lái)說(shuō)，冰凍切片的片子較厚（約10-30 um），一般設定刀片溫度為-10~-20度，如設定溫度太低，可能會(huì )切不好；石蠟切片的片子較?。s5-10 um）。 b. 確認已使用適當厚度的蓋玻片，如使用油鏡一定要滴油。 c. 建議使用激光共聚焦顯微鏡成像，去除非焦點(diǎn)平面的噪質(zhì)。
固定不或造成物理?yè)p傷	a. 增加固定時(shí)間。如使用4 % PFA，一般建議至少固定6小時(shí)以上，18~24小時(shí)已可滿(mǎn)足大多數實(shí)驗應用，可依據染色結果增加固定時(shí)間與/或加入后固定的步驟。注：如固定時(shí)間到了無(wú)法繼續后續脫水、包埋程序，一定要將組織置換到PBS保存，切勿一直泡于固定液中。 b. 增加固定液/組織比例，建議固定液體積至少要是組織塊的20倍體積。 c. 準備較小的組織塊（約3-4 mm），以迸行更q的浸潤固定。
抗原修復過(guò)于強烈	a. 憑經(jīng)驗決定保留組織型態(tài)的條件，同時(shí)恢復抗原的免疫反應性。理論上溫度越高，酸堿值越堿，但可能造成較高的背景值或組織型態(tài)破壞，因此，建議從92°C, pH 6開(kāi)始嘗試，pH 6的抗原修復液即適用于大多數抗體。 b. 使用冰凍切片樣本。冰凍切片一般不做抗原修復，因為抗原修復方式對冰凍切片可能太過(guò)強烈，也不需脫蠟、覆水等步驟，能夠較完好地保存細胞膜表面和細胞內多種酶活性以及抗原的免疫活性。
切片組織細胞形成冰晶	a. 防止組織中冰晶形成： -速凍使組織溫度驟降, 減少冰晶的形成。 -固定后將組織置于20％～30％蔗糖溶液1～3天，利用高滲吸收組織中水分, 減少組織含水量，可防止或減少冰晶的形成。

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