inspiralis ——————超螺旋檢測

DNA 旋轉酶是一種不一樣的拓撲異構酶，因為它是能夠催化 DNA 負超螺旋的酶。該過(guò)程依賴(lài)于 ATP，通過(guò)雙鏈 DNA 的切割和重新連接以 2 步進(jìn)行。

有關(guān)該反應的概述，請參閱：McKie ,  SJ 、  Neuman,  KC和 Maxwell,  A.  ( 2021 )。DNA 拓撲異構酶：通過(guò)結構功能分析進(jìn)一步了解細胞作用和多蛋白復合物。BioEssays  ，  43 ，e2000286。

典型反應如下：

將 1 U DNA 促旋酶與 0.5 µg 松弛 pBR322 DNA 在 30 µl 反應體系中在 1X 檢測緩沖液中于 37°C 下孵育 30 分鐘

通過(guò)添加 30 µl 氯仿/異戊醇 (24/1) 和 30 µl 終止緩沖液 (STEB：40% 蔗糖、100 mM Tris.HCl (pH 7.5)、100 mM EDTA、0.5 mg/ml 溴酚藍) 來(lái)終止每個(gè)反應，然后將其加載到瓊脂糖凝膠上。(0.8%-1.0%：w/v)

凝膠可以在 TBE（90 mM Tris.Borate、2 mM EDTA）或 TAE（40 mM Tris.Acetate、2 mM EDTA）中運行，但如果在 TAE 中以最高 90V 運行 2 - 3 小時(shí)，超螺旋 pBR322 的分辨率會(huì )好得多。

典型凝膠：

所用的 DNA 底物（本例中為松弛的 pBR322）通常由瓊脂糖凝膠上的一系列條帶組成。這些條帶是拓撲異構體（具有不同連接數的 DNA）。

用 DNA 促旋酶處理松弛的 pBR322 可將松弛的拓撲異構體轉化為質(zhì)粒的超螺旋形式，后者在瓊脂糖凝膠上遷移速度更快。還可以看到上部條帶，這是開(kāi)環(huán)（有缺口）DNA，它存在于松弛的基質(zhì)中，但與一些松弛的拓撲異構體一起遷移。

嵌入劑

如果凝膠槽中存在溴化乙錠或氯喹等污染物，則檢測可能會(huì )出現問(wèn)題。這些化學(xué)物質(zhì)是嵌入劑，會(huì )影響 DNA 的移動(dòng)性，導致結果混亂。如果緩沖液中存在嵌入劑，則松弛的拓撲異構體會(huì )提高移動(dòng)性，并大致在與負超螺旋質(zhì)粒相同的位置運行。根據嵌入劑的量，負超螺旋 DNA 的移動(dòng)性可能略低于正常水平。

核酸酶

如果檢測中存在污染性核酸酶（由于檢測緩沖液被污染或細胞表達的不純級分），切口可能會(huì )顯著(zhù)增加，從而導致開(kāi)環(huán) DNA 的數量增加，并可能產(chǎn)生線(xiàn)性 DNA。這在 OC 和 SC 之間以單一帶的形式運行。

ATP

之前活性酶的活性喪失可能是由于緩沖液中 ATP 的劣化所致，盡管 5X 檢測緩沖液已被開(kāi)發(fā)以盡量減少這種情況。如果發(fā)生活性喪失，則在反應中添加額外的 ATP 將克服該問(wèn)題。

北京和一生物科技有限公司專(zhuān)業(yè)代理antibodiesinc全系列產(chǎn)品，專(zhuān)營(yíng)進(jìn)口生物試劑，科學(xué)儀器，實(shí)驗消耗品，化工原料及藥物中間體等。公司與諸多國外品牌簽下代理，sigma、santa、RD、Abcam、CST、toxin、streck、Biolegend、ebioscience、saracare、polyplus、Beyotime、Novus、moltox等，能為廣大科研用戶(hù)提供數萬(wàn)種試劑、儀器和實(shí)驗消耗品。

我們公司的優(yōu)勢:

1：與500多家公司合作，基本什么品牌都能進(jìn)口，包括血清，抗體，耗材，還有部分限制進(jìn)口的

2：部分產(chǎn)品現貨，物流穩定

3：一手貨源，價(jià)格價(jià)格優(yōu)，售后齊全，歡迎新老客戶(hù)咨詢(xún)訂購